Méthodes d'étude pour le développement de médicaments oculaires
F. Behar-Cohen, N. Bonneau, F. Brignole-Baudouin
L'essentiel
Environ 10 ans séparent l'identification d'une cible médicamenteuse qui pourrait être utile dans le traitement d'une maladie oculaire et les premiers essais cliniques.
Plusieurs types de tests sont requis, visant à confirmer la pertinence de la cible dans différents modèles animaux et chez l'homme, à développer des molécules et des formulations utilisables chez l'homme et dont la biodisponibilité permet d'atteindre la cible dans les tissus ou cellules spécifiques, à réaliser des études pharmacocinétiques et toxicologiques réglementaires et, enfin, des tests de production.
Un plan de développement doit être soigneusement établi, tirant parti des modèles in silico, cellulaire, ex vivo et in vivo.
Il est essentiel d'utiliser le minimum d'animaux et d'avoir recours, chaque fois que cela est possible, à des méthodes de substitution.
Ces phases de développement doivent faire intervenir les agences réglementaires afin de réaliser certaines étapes dans des laboratoires certifiés.
Ces phases de développement sont essentielles pour permettre l'émergence de nouveaux médicaments et d'options thérapeutiques innovantes.
Introduction
Quand une molécule ou une cible médicamenteuse ont été identifiées par des chercheurs, il est nécessaire de démontrer leurs effets biologiques sur différents modèles, de réaliser des études pharmacodynamiques, dont l'établissement de la courbe dose-réponse, ainsi que de conduire des études pharmacocinétiques, de rechercher des effets toxiques potentiels, et de formuler la molécule dans une préparation qui optimise sa biodisponibilité dans le tissu vers les cellules cibles. Lors de la production du médicament, la stabilité, les méthodes de stérilisation et de conservation devront être testées. Si toutes ces étapes de recherche préclinique ne sont pas franchies, le médicament ne pourra pas parvenir à l'étape de la recherche clinique. Il convient donc d'obtenir le plus rapidement possible des réponses de poursuite ou d'arrêt du programme expérimental. Moins de 1 % des molécules identifiées comme possédant des propriétés biologiques intéressantes franchiront l'étape du passage en essai clinique et le délai moyen pour franchir toutes ces étapes est de 13 ans [1].
Plusieurs modèles précliniques ou non cliniques peuvent être utilisés. Ils ont chacun leurs avantages, inconvénients et limites. Afin de respecter le règle des 3R, « réduire, raffiner, remplacer», de l'expérimentation animale, plusieurs modèles complémentaires à celle-ci doivent être utilisés [2].
Les différents types de modèles utilisés en recherche préclinique et non clinique
Ces modèles sont utilisés pour valider les cibles et comprendre les mécanismes d'action des médicaments.
Modèles in silico
Le terme in silico est utilisé pour indiquer que la recherche est effectuée via une simulation informatique. Ce type de recherche comprend des études pour la découverte de médicaments, l'analyse de la structure des protéines, des analyses génomiques, protéomiques, métabolomiques, bio-informatiques et biostatistiques. La biologie computationnelle est le terme utilisé pour désigner la discipline qui utilise ces données biologiques pour développer des algorithmes et des relations au sein de systèmes biologiques complexes, ou analyser de grands ensembles de données biologiques obtenus à partir d'échantillons humains ou d'études in vivo ou in vitro [3 , 4]. Ce domaine est en constante évolution et se développe grâce à l'interaction de diverses compétences (bio-informatique, physique, mathématique, biologie, etc.). Inspirées de l'approche PB-PK, ou physiologically-based pharmacokinetics (modèle mathématique utilisé pour prédire les paramètres d'absorption, de distribution, de métabolisme d'élimination et de toxicité d'une substance [ADMET]), ces méthodes sont utilisées depuis quelques années pour découvrir les mécanismes de maladies oculaires et de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles [5-6-7-8] en prenant en compte le métabolisme local, les structures barrières, etc., et pour estimer les doses responsables d'un effet [9].
Dans le cas de l'œil, il est fondamental de représenter in silico les trois grands facteurs conditionnant la pénétration et la distribution au niveau de la surface oculaire : les barrières statiques avec les différents systèmes de passage/transport (claudines, zonula occludens, etc.), les clairances dynamiques accompagnées des différents composés impliqués (glycoprotéines, mucines, phospholipides du film lacrymal) et les facteurs métaboliques (enzymes, transporteurs, pompes d'efflux, récepteurs tels que les estérases, cytochromes, phosphatases, pompe NA + /K + -ATPase, etc.). Des méthodes in silico, alternatives au test de Draize, se sont avérées efficaces pour identifier la toxicité d'irritants oculaires [10].
En raison des coûts associés à ces analyses à grande échelle, un nombre relativement faible d'échantillons est généralement choisi. Par conséquent, des contrôles appropriés doivent être utilisés. La recherche in silico est particulièrement adaptée à la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques ou de nouvelles molécules, car c'est une recherche qui peut se faire sans a priori [11 , 12].
Avantages des modèles in silico
Ces modèles :
ne nécessitent pas une configuration expérimentale dans un laboratoire, limitent l'utilisation d'animaux et peuvent s'effectuer sur des échantillons existants s'ils ont été bien conservés (en particulier des échantillons humains);
intègrent toutes les informations recueillies jusqu'à présent par des centaines de chercheurs, sur plusieurs ensembles de données;
permettent la comparaison croisée de données provenant de plusieurs sources (métabolomique, génomique, etc.) et de plusieurs espèces, ce qui rend les résultats relativement robustes.
Limites des modèles in silico
Les limites sont les suivantes :
ces modèles nécessitent des connaissances préalables en bio-informatique et, dans certains cas, en programmation;
parfois, la richesse de l'information est très importante, ce qui nécessite l'utilisation d'une puissance de calcul considérable;
le rapport signal/bruit est parfois faible, ce qui rend difficile l'extraction d'informations fiables;
les résultats consistent toujours en des valeurs prédictives, qui doivent être validées en fin de compte au niveau expérimental.
Modèles in vitro
Modèles cellulaires
Les modèles cellulaires reposent sur la mise en culture de cellules issues de différents tissus (cornée, cristallin, épithélium pigmentaire, etc.), d'origine animale ou humaine. Les cellules peuvent être cultivées seules en deux dimensions, ou avec d'autres types cellulaires pour mimer des tissus (modèles tridimensionnels) ou mimer les relations intercellulaires existant dans un tissu (par exemple co-culture de cellules de l'épithélium pigmentaire avec des cellules endothéliales) [ 13 , 14], ou dans des systèmes complexes qui forment un micro-environnement spécifique ( organ-on-a-chip ; voir tableau 5-1
Tableau 5-1
Modèles alternatifs innovants utilisables en préclinique et en non clinique pour l'évaluation des effets pharmacologiques et des toxicités de la surface oculaire.
Tableau 5-1 Modèles alternatifs innovants utilisables en préclinique et en non clinique pour l'évaluation des effets pharmacologiques et des toxicités de la surface oculaire. Tableau 5-1
Modèles 3D multicellulaires
Modèles on-a-chip
Organoïdes
Co-culture conjonctive/glandes lacrymales
Co-culture neurones SH-SY5Y/cellules cornéennes stromales sur insert
Cellules primaires murines de ganglions trigéminés (améliorations possibles par l'ajout de cellules épithéliales cornénnes)
Lignée IMR90.4 iPS
Cellules humaines pluripotentes embryoniques (hESC line CA1)
Avantages
Production des phases aqueuse et mucinique du film lacrymal
Production de novo de matrice extracellulaire par les fibroblastes
Mime les interactions nerfs/stroma
Interface air-liquide et matrice en protéines de soie pour mimer les propriétés mécaniques de la cornée et améliorer le développement neuronal
Mime les flux pulsatiles générés par le clignement des paupières
Mime le flux continu généré par la sécrétion lacrymale
Mime les flux bidirectionnels générés par le clignement des paupières
Mime l'élimination de l'humeur aqueuse par le canal de Schlemm (flux unidirectionnel)
Mime le stroma via la matrice en collagène
Mime le flux lacrymal via le système de perfusion
Mime le clignement des paupières via le système biomimétique
Sépare les terminaisons nerveuses (compartiment distal) des corps cellulaires (compartiment proximal) pour une meilleure représentation de la physiologie et évaluer l'impact d'un toxique sur les terminaisons nerveuses de la surface oculaire
Structure lamellaire de la cornée (épithélium, stroma, endothélium) identifiable au bout de 30 jours de culture
Formation d'une structure fibrillaire caractéristique du cristallin
Paramètres évalués
Perméabilité des jonctions serrées de l'épithélium conjonctival au dextran
Épaisseur du film lacrymal
Marqueur épithélial (KRT4)
Marqueur mucinique (MUC5AC)
Marqueur inflammatoire (IL-1β, MMP)
Marqueur collagénique et de fibrose (alpha-SMA)
Changements structuraux (microscopie électronique à transmission)
Phénotype de l'épithélium cornéen et du stroma (involucrine, KRT3, connexine 37, ALDH3A1)
Épaisseur de l'épithélium
Phénotype de l'épithélium (ZO-1)
Perméabilité membranaire (TEER)
Épaisseur de l'épithélium
Phénotype de l'épithélium cornéen (ZO-1, KRT19, KRT12)
Perméabilité de l'épithélium (fluorescéine, dextran)
Épaisseur de l'épithélium
Phénotype de l'épithélium cornéen (p63, KRT19, KRT3)
Épaisseur du film lacrymal
Cytokines inflammatoires (IL-β, TNF-α) et métalloprotéinases (MMP-9)
Marqueurs inflammatoires
Marqueurs de morts cellulaires
Altération de la morphologie des axones (coloration au CFSE)
Épaisseur de la structure lamellaire
Phénotype de l'épithélium cornéen (KRT3, KRT14, p63α, KERA, collagène de type I/V/VIII, LUM)
Organisation du collagène en fibrilles (microscopie électronique à transmission)
Phénotype du cristallin (ROR, cristallines α et β, intégrines, laminines et collagènes)
Capacité de convergence de la lumière
Références
Lu et al., 2017
Sharif et al., 2018
Wang et al., 2015 Wang et al., 2017
Bennet et al., 2018
Abdalkader et Kamei, 2018 Bai et al., 2020
Seo et al., 2019
Sarkar et al., 2012 Courte et al., 2018
Foster et al., 2017 Susaimanickam et al., 2017 Foster et al., 2020
Murphy et al., 2018
) [15-16-17]. Elles peuvent être cultivées sur des supports particuliers pour étudier des transports ou des contraintes mécaniques par exemple [ 18]. Les lignées cellulaires sont des types de cellules spécifiques, théoriquement purs. Les lignées immortalisées ont été modifiées pour survivre de façon indéfinie en gardant leurs caractères de différenciation. Ces lignées doivent être très bien caractérisées pour s'assurer qu'elles n'ont pas été contaminées par d'autres types cellulaires et qu'elles possèdent bien les propriétés des cellules recherchées. En effet, les lignées immortalisées peuvent contenir des modifications génétiques qui influent sur les études menées et sur les questions posées. Enfin, toutes ces lignées peuvent, au cours des divisions, subir des modifications, perdre leurs caractéristiques, dériver, etc. Des contrôles réguliers du phénotype sont donc nécessaires [19]. Les cellules primaires sont des cellules séparées d'un tissu et cultivées dans leur état de différenciation initiale. Comme leur nom l'indique, ces cellules doivent être utilisées dès leur première mise en culture et perdent leurs caractéristiques de différenciation lors des passages successifs. Les cellules d'origine animale peuvent être obtenues facilement et en grande quantité, à partir d'animaux homogènes sur un fond génétique connu. Mais elles peuvent s'éloigner des cellules humaines et avoir des propriétés différentes. Les cellules primaires humaines sont plus proches de la physiopathologie humaine, mais elles sont rares et moins homogènes, variant en fonction des donneurs. Leur coût est donc très élevé car elles doivent être caractérisées pour chaque donneur. Les cellules animales sont très utiles pour des expériences de criblage, car on peut en obtenir un très grand nombre, y compris à partir de modèles pathologiques. Mais une validation sur des cellules humaines est souhaitable. Les cellules primaires conservent les activités enzymatiques et la signalisation du tissu dont elles sont issues et sont donc adaptées pour étudier la toxicité de molécules, mais ne peuvent pas être utilisées pour du criblage car leur nombre est limité et les passages peu fréquents. Récemment, un nouveau type de cellules a été obtenu par différenciation de cellules souches pluripotentes. À partir de cellules de la peau (fibroblastes) ou à partir de monocytes, il est devenu possible de produire des cellules souches pluripotentes (cellules iPS ou induced-pluripotent stem cells ) [20-21-22-23] qui, selon différents protocoles, peuvent devenir des cellules de l'épithélium pigmentaire, des neurosphères, des cellules rétiniennes ou cornéennes et même un organoïde rétinien [24 , 25]. Ainsi, il devient possible de produire, pour un individu donné, des cellules de sa propre rétine en ne réalisant qu'une prise de sang. Ces cellules sont largement utilisées pour valider des traitements de thérapie génique, en particulier quand les modèles animaux ne récapitulent pas la pathologie humaine. Mais, à ce jour, ces cellules ne sont pas utilisées en remplacement des cellules du donneur parce que les étapes de leur production sont longues et nécessitent l'utilisation de virus ou de modificateurs génétiques dangereux pour l'homme.
Avantages des modèles cellulaires
Les avantages sont :
facilité d'utilisation, possibilité de disposer d'un grand nombre de cellules pour du criblage;
rapidité et absence de contraintes réglementaires liées à l'expérimentation animale;
bonne reproductibilité;
grande flexibilité des stimuli et conditions à tester;
possibilité d'étudier des mécanismes précis, spécifiques d'un type cellulaire.
Inconvénients des modèles cellulaires
La transposition des résultats à la pathologie humaine doit être faite avec prudence.
Les résultats doivent être confirmés avec d'autres modèles.
Explants et organoïdes
Un explant consiste à maintenir en culture un tissu organisé pour étudier l'effet d'un médicament ou pour induire une condition pathologique. On peut ainsi étudier la cornée, la rétine, le cristallin, l'épithélium pigmentaire, le complexe choroïde/sclère, etc. [ 26]. L'avantage de ces systèmes est de disposer d'une organisation optimale et proche des cellules avec le maintien des relations intercellulaires et de l'organisation structurelle du tissu. L'inconvénient est que la plupart des tissus ne peuvent être maintenus que sur des durées très limitées. Les tissus d'origine animale sont obtenus facilement et peuvent provenir de modèles pathologiques. Les tissus d'origine humaine sont plus rares, moins homogènes, mais très précieux, en particulier quand le tissu animal diffère du tissu humain (par exemple la macula). Les organoïdes sont, quant à eux, des structures 3D, dérivées de cellules souches embryonnaires (ES) ou d'iPS, capables d'auto-organisation sur leur support (type hydrogel, matrice poreuse, etc.) [27-28-29]. Ils permettent d'obtenir des structures cellulaires complexes de phénotype humain et de s'affranchir du besoin de tissus biologiques rares. Récemment, des structures rétiniennes humaines organisées ont été produites par ces technologies, et les transcriptomes des différents types cellulaires et leur localisation topographique (macula versus périphérie) ont démontré une excellente corrélation avec des rétines humaines natives, démontrant la pertinence de ces systèmes pour la recherche thérapeutique [30]. Des essais de thérapie génique ont été effectués sur ces modèles cellulaires issus d'iPS de patients [ 31 , 32]. Il ne fait aucun doute que ces méthodes seront de plus en plus utilisées et pourront à terme remplacer les modèles animaux, au moins pour les premières phases de validation, et à terme peut-être pour toutes les phases de développement des médicaments. De nombreux modèles de maladies de la rétine ont été développés et sont actuellement testés [ 33]. Par ces méthodes, Foster et al. 2017 [ 34] et Murphy et al. [35] ont également pu obtenir respectivement un organoïde de cornée et un organoïde de cristallin. Ce modèle de cristallin a notamment été utilisé pour évaluer la toxicité d'un composé en développement dans la mucoviscidose, le Vx-770. En effet, cette molécule s'est révélée induire des cataractes toxiques chez le rat et cliniquement. Ainsi, après avoir laissé leur modèle acquérir la transparence maximale et un phénotype proche de celui du cristallin humain, Murphy et al. [35] ont testé plusieurs doses et ont constaté, à la forte dose, une réduction significative de la capacité de ce cristallin artificiel de faire converger la lumière, démontrant le potentiel de ce type de modèle in vitro. Les modèles in vitro ont connu une véritable révolution depuis le développement de cellules différenciées à partir de cellules souches pluripotentes ou iPS dérivées de fibroblastes humains ou de monocytes. À partir de ces cellules, il est aussi possible de reconstituer un tissu (cornée, cristallin, rétine) et d'étudier les effets des médicaments, ou de tester ceux-ci sur les cellules issues de patients qui présentent la pathologie ciblée. Le tableau 5-1
Tableau 5-1
Modèles alternatifs innovants utilisables en préclinique et en non clinique pour l'évaluation des effets pharmacologiques et des toxicités de la surface oculaire.
Tableau 5-1 Modèles alternatifs innovants utilisables en préclinique et en non clinique pour l'évaluation des effets pharmacologiques et des toxicités de la surface oculaire. Tableau 5-1
Modèles 3D multicellulaires
Modèles on-a-chip
Organoïdes
Co-culture conjonctive/glandes lacrymales
Co-culture neurones SH-SY5Y/cellules cornéennes stromales sur insert
Cellules primaires murines de ganglions trigéminés (améliorations possibles par l'ajout de cellules épithéliales cornénnes)
Lignée IMR90.4 iPS
Cellules humaines pluripotentes embryoniques (hESC line CA1)
Avantages
Production des phases aqueuse et mucinique du film lacrymal
Production de novo de matrice extracellulaire par les fibroblastes
Mime les interactions nerfs/stroma
Interface air-liquide et matrice en protéines de soie pour mimer les propriétés mécaniques de la cornée et améliorer le développement neuronal
Mime les flux pulsatiles générés par le clignement des paupières
Mime le flux continu généré par la sécrétion lacrymale
Mime les flux bidirectionnels générés par le clignement des paupières
Mime l'élimination de l'humeur aqueuse par le canal de Schlemm (flux unidirectionnel)
Mime le stroma via la matrice en collagène
Mime le flux lacrymal via le système de perfusion
Mime le clignement des paupières via le système biomimétique
Sépare les terminaisons nerveuses (compartiment distal) des corps cellulaires (compartiment proximal) pour une meilleure représentation de la physiologie et évaluer l'impact d'un toxique sur les terminaisons nerveuses de la surface oculaire
Structure lamellaire de la cornée (épithélium, stroma, endothélium) identifiable au bout de 30 jours de culture
Formation d'une structure fibrillaire caractéristique du cristallin
Paramètres évalués
Perméabilité des jonctions serrées de l'épithélium conjonctival au dextran
Épaisseur du film lacrymal
Marqueur épithélial (KRT4)
Marqueur mucinique (MUC5AC)
Marqueur inflammatoire (IL-1β, MMP)
Marqueur collagénique et de fibrose (alpha-SMA)
Changements structuraux (microscopie électronique à transmission)
Phénotype de l'épithélium cornéen et du stroma (involucrine, KRT3, connexine 37, ALDH3A1)
Épaisseur de l'épithélium
Phénotype de l'épithélium (ZO-1)
Perméabilité membranaire (TEER)
Épaisseur de l'épithélium
Phénotype de l'épithélium cornéen (ZO-1, KRT19, KRT12)
Perméabilité de l'épithélium (fluorescéine, dextran)
Épaisseur de l'épithélium
Phénotype de l'épithélium cornéen (p63, KRT19, KRT3)
Épaisseur du film lacrymal
Cytokines inflammatoires (IL-β, TNF-α) et métalloprotéinases (MMP-9)
Marqueurs inflammatoires
Marqueurs de morts cellulaires
Altération de la morphologie des axones (coloration au CFSE)
Épaisseur de la structure lamellaire
Phénotype de l'épithélium cornéen (KRT3, KRT14, p63α, KERA, collagène de type I/V/VIII, LUM)
Organisation du collagène en fibrilles (microscopie électronique à transmission)
Phénotype du cristallin (ROR, cristallines α et β, intégrines, laminines et collagènes)
Capacité de convergence de la lumière
Références
Lu et al., 2017
Sharif et al., 2018
Wang et al., 2015 Wang et al., 2017
Bennet et al., 2018
Abdalkader et Kamei, 2018 Bai et al., 2020
Seo et al., 2019
Sarkar et al., 2012 Courte et al., 2018
Foster et al., 2017 Susaimanickam et al., 2017 Foster et al., 2020
Murphy et al., 2018
présente un ensemble de modèles alternatifs innovants (3D multicellulaires, modèles sur puces, organoïdes, etc.) utilisables en non-clinique pour l'évaluation des effets pharmacologiques et des toxicités de la surface oculaire.
Milieux oculaires
Les milieux oculaires sont une source importante d'informations sur le métabolisme des tissus, et permettent d'identifier des cibles thérapeutiques et des biomarqueurs. L'humeur aqueuse, le vitré, le liquide sous-rétinien et même les larmes sont utilisés en recherche ophtalmologique. Il est essentiel d'effectuer des prélèvements de milieux purs non dilués et de les conserver sans retard à très basse température pour préserver leur contenu et établir des procédures de biobanking [36]. Par exemple, le VEGF ( vascular endothelial growth factor ) a été identifié dans le vitré de patients diabétiques pour la première fois par une équipe française, ouvrant la voie aux traitements anti-angiogéniques [ 37]. Les milieux oculaires d'origine animale sont plus faciles à obtenir et plus homogènes, mais le volume très faible chez les rongeurs rend leur utilisation difficile. Les milieux oculaires humains sont une source très précieuse, mais leur collection et leur conservation sont soumises à des restrictions réglementaires et le phénotypage complet des patients est indispensable à l'interprétation des résultats. Ces dernières années, des études omics (protéomique [6 , 38-39-40], métabolomique [ 41 , 42], lipidomique [43 , 44]) non ciblées ont été réalisées sur des milieux oculaires (larmes, humeur aqueuse et vitré) de patients atteints de différentes pathologies oculaires, permettant d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. L'analyse de milieux oculaires a aussi permis de valider des cibles médicamenteuses en démontrant la variation de métaux comme le fer [45] ou des corticoïdes en situation pathologique [46]. Les milieux oculaires sont aussi essentiels pour établir des modèles pharmacocinétiques chez l'homme, souvent une fois que les médicaments ont été mis sur le marché [47]. De façon intéressante, il apparaît que les larmes sont une source d'information facile d'accès, non seulement pour les pathologies de la surface oculaire [48], mais aussi pour les pathologies intraoculaires [49]. Par exemple, le taux de malondialdéhyde (MDA), un marqueur de stress oxydant est corrélé à l'importance du liquide sous-rétinien au cours de la choriorétinopathie séreuse centrale [50].
Avantages des milieux oculaires
Ce sont les suivants :
matériel liquide qui peut être analysé par des méthodes non biaisées;
proximité avec la pathologie;
permettent de valider des cibles thérapeutiques;
permettent d'identifier des biomarqueurs de toxicité et d'efficacité des traitements;
contribuent au développement d'une médecine personnalisée.
Limites des milieux oculaires
Les limites sont :
la nécessité d'un phénotypage complet;
la variabilité;
la nécessité d'avoir des contrôles phénotypés sur le plan ophtalmologique.
Modèles in vivo
L'expérimentation animale est régulièrement contestée au niveau européen et, aujourd'hui encore, des initiatives tentent de l'interdire. En effet, l'interdiction complète d'expérimenter sur l'animal pour les tests de cosmétiques introduite en 2013 (règlement CE n° 1223/2009 du Parlement européen, dénommé « Règlement cosmétique» et transposé en France dans le Code de la santé publique par la loi n° 2014-201 du 24 février 2014) tend à s'étendre au médicament avec un glissement progressif de l'obligation à respecter la règle des 3R [51] à une totale interdiction possible de l'utilisation des animaux en recherche. Il est important de limiter au maximum l'utilisation d'animaux à des fins de recherche, d'en réduire le nombre en calculant le nombre d'animaux suffisant et nécessaire pour obtenir une réponse statistiquement significative, et d'utiliser toutes les méthodes alternatives avant d'y avoir recours. En particulier, en Europe, l'utilisation des primates non humains est soumise à une réglementation stricte avec un fichier national permettant de mutualiser au mieux les animaux.
Bien que des méthodes alternatives se développent, la toxicité oculaire des médicaments doit, encore à l'heure actuelle, être évaluée à partir d'expérimentations in vivo sur deux espèces distinctes (rongeur et non-rongeur, par exemple, études de toxicité réitérée ICH S4 [52]), avant d'autoriser les essais chez l'homme.
L'utilisation des primates n'est pas requise par les autorités réglementaires et les plans expérimentaux peuvent être discutés avec les autorités en France, en Europe et aux États-Unis. Alors qu'aux États-Unis, les avis émis par la Food and Drug Administration (FDA) ont une valeur d'approbation, ce n'est pas le cas en France et en Europe, où les avis sont uniquement indicatifs.
La recherche sur des animaux est très encadrée par des législations : les personnes habilitées à expérimenter doivent avoir suivi des formations qui, après validation par les autorités réglementaires, permettent d'obtenir une autorisation à expérimenter de la part du Ministère et doivent suivre des mises à niveau régulières. Les animaleries sont contrôlées et soumises à des réglementations très strictes. Les protocoles sont évalués par des comités d'éthique et de bien-être animal. Tout écart à ces réglementations relève de la juridiction pénale.
Des guides de bonnes pratiques européens ont été rédigés par des experts, puis validés par les États membres. Ils permettent de donner des compléments d'informations et des exemples concrets pour la mise en application du dispositif réglementaire, plus particulièrement sur la démarche éthique et la classification du degré de sévérité des procédures. Dans le domaine de l'expérimentation animale, la directive européenne n° 2010/63/UE, révisant la directive n° 86/609/CEE du Conseil du 24 novembre 1986, est applicable en France depuis le 1 er janvier 2013. La règle des 3R consiste à r emplacer l'expérimentation animale dès que possible, et à défaut, à r éduire le nombre d'animaux utilisés et à r affiner les procédures, c'est-à-dire optimiser les méthodologies employées pour diminuer la douleur animale tout en garantissant un niveau de résultats scientifiques élevé. De plus, cette utilisation doit être pleinement justifiée scientifiquement. Ainsi, les avantages escomptés doivent l'emporter sur les préjudices causés aux animaux. En ophtalmologie, il est essentiel de combiner des anesthésies générales et locales afin de minimiser la souffrance animale. L'utilisation d'un seul œil quand la procédure affecte la vision ou est douloureuse est requise, mais les deux yeux peuvent être utilisés selon les protocoles expérimentaux quand cela permet de réduire le nombre d'animaux. Les résultats doivent être interprétés en fonction de cette donnée. Il est aussi recommandé de mutualiser l'utilisation d'autres organes avec des équipes partenaires pour limiter le nombre global d'animaux utilisés.
Les animaux classiquement utilisés sont les rongeurs (rats et souris), pour lesquels il existe un très grand nombre d'espèces modifiées génétiquement ou que l'on peut modifier génétiquement assez facilement aujourd'hui. Les lagomorphes (lapins) sont aussi utilisés en ophtalmologie parce que la taille de leurs yeux est proche de celle des humains. Les primates non humains sont réservés à des expériences spécifiques du fait de leur coût, de la pénurie mondiale de ces animaux pour l'expérimentation et des restrictions éthiques. D'autres espèces sont utilisées pour étudier le développement oculaire et du système visuel comme les poussins, le poisson-zèbre ( zebrafish ) ou encore la drosophile ou le xénope. Des animaleries adaptées sont alors nécessaires.
L'expérimentation animale visant à évaluer des effets de molécules actives, de drogues ou de toxiques peut être réalisée dans des laboratoires académiques, mais les expérimentations animales menées en vue d'obtenir des autorisations d'études chez l'homme (pharmacocinétique et toxicité) doivent être menées dans des laboratoires contrôlés et accrédités par les autorités réglementaires ( contract research organization [CRO]). Ces laboratoires suivent des normes de bonnes pratiques et subissent des contrôles qui garantissent la traçabilité et la pérennité des données. Les résultats doivent être conservés 10 ans et l'ensemble des résultats doit être accessible et faire l'objet de rapports.
Avantages des modèles in vivo
Les avantages sont les suivants :
évaluation d'un événement biologique complexe dans un environnement réel;
observation et analyse longitudinales;
étude des processus physiologiques et développementaux;
étude de la fonction visuelle et du comportement;
test de tolérance des médicaments;
études de la pharmacocinétique;
possibilité de créer des modèles animaux modifiés génétiquement.
Limites des modèles in vivo
Les limites sont les suivantes :
le nombre d'animaux est limité par des considérations éthiques;
la variabilité est beaucoup plus élevée que dans les expériences in vitro;
de nombreux paramètres non contrôlés peuvent interférer avec les expériences (lumière, nourriture, stress, infection, etc.);
un apprentissage est nécessaire;
les modèles ne récapitulent pas complètement la pathologie humaine;
les réactions immunes humaines ne peuvent pas être étudiées de façon fiable sur des animaux (même les primates non humains).
Généralement, plusieurs modèles sont utilisés pour étudier les effets d'une nouvelle molécule. Par exemple, de nombreux modèles d'études in vivo de la sécheresse oculaire ont été développés ces dernières années pour aider à la compréhension fine des mécanismes impliqués dans cette pathologie. On distingue les modèles chimiques par instillation/injection répétée de molécules inhibant la sécrétion lacrymale (comme un antimuscarinique tel que l'atropine [53]) ou de molécules altérant la couche lipidique du film lacrymal (telle que le chlorure de benzalkonium [BAC] [54-55-56-57]; les modèles chirurgicaux avec ablation des glandes lacrymales ou des glandes de Meibomius, ou avec dénervation par section des nerfs ciliaires [58-59-60-61-62-63]; les modèles par excès d'évaporation générant un environnement dessicatif à faible hygrométrie [64]; les modèles hyperosmolaires déstabilisant le film lacrymal (instillation de solution saline [65]); et les modèles génétiquement modifiés pour développer une sécheresse oculaire (souris Aire-KO) [ 66]. Pour les pathologies rétiniennes, il existe un nombre très important de modèles de dégénérescence de la rétine, soit du fait de modifications génétiques induites ou spontanées, soit par exposition à des agents physiques (lumière, laser, etc.), ou à des agents chimiques (méthylnitrosourée, pentosane polysulfate, fer, acide alpha amino-adipique, etc.). Des modèles d'angiogenèse choroïdienne sont utilisés pour valider des molécules utilisées en clinique comme les anti-angiogéniques, et des modèles d'angiogenèse développementale servent à observer des effets sur les vaisseaux de la rétine. De multiples modèles de diabète sont aussi utilisés avec des rétinopathies variables selon les modèles [ 67 , 68]. Les modèles modifiés génétiquement ou animaux transgéniques sont très utilisés, depuis que des outils nouveaux ont permis non seulement de générer des animaux qui sur- ou sous-expriment une protéine, mais également de contrôler à quel moment et dans quelles cellules induire ces modifications (système inductible). Ces modèles sont très précieux et apportent des informations essentielles pour identifier des cibles et analyser les effets de leur activation ou inhibition. Actuellement, ces modèles sont générés sur des rongeurs qui ne possèdent pas de macula, ce qui limite la création de modèles de pathologie rétinienne complètement transposables à l'homme. Enfin, plus un système est complexe, plus les risques de biais aux différentes étapes des expériences augmentent, ce qui nécessite un nombre de contrôles croissant. Le tableau 5-2
Tableau 5-2
Principaux avantages et inconvénients des espèces animales utilisées en recherche ophtalmologique.
Tableau 5-2 Principaux avantages et inconvénients des espèces animales utilisées en recherche ophtalmologique. Tableau 5-2
Espèces
Drosophile
Poisson zèbre
Poulet
Porc
Lapin
Avantages et utilisation
Mutations génétiques faciles
Très grand nombre d'animaux et de générations
Temps court de reproduction
Taille et structure de l'œil compatibles avec son étude
Mutations génétiques faciles
Animal transparent
Grand nombre possible
Temps court de reproduction
Adapté aux études développementales
Adapté aux études de criblage de médicaments et de toxicité
Possibilité d'étudier les œufs
Grand nombre
Temps court de reproduction
Adapté pour les études sur la myopie de déprivation et les études d'angiogenèse
Grande taille des yeux
Rétine enrichie en cônes et area centralis
Adapté à la chirurgie
Possibilité d'utiliser les instruments d'exploration cliniques
Grande taille des yeux (proche de l'humain)
Adapté aux études de pharmacocinétique et de toxicologie
Temps court de reproduction
Adapté à la production d'anticorps
Limitations
Œil très différent de l'œil humain
Manipulation complexe
Peu d'outils biologiques
Équipements spécifiques
Distance évolutive
Œil très différent de l'œil humain
Manipulation complexe
Peu d'outils biologiques
Équipements spécifiques
Distance évolutive
Œil très différent de l'œil humain
Séquençage incomplet du génome
Coût et complexité de manipulation
Nombre restreint
Séquençage incomplet du génome
Peu d'outils biologiques
Séquençage incomplet du génome
Rétine et cornée différentes de l'humain
Réponse immune
Peu d'outils biologiques
Espèce
Chat
Chien
Souris
Rat
Primate non humain
Avantages et utilisation
Taille de l'œil
Mutations spontanées similaires à celles de l'homme
Modèles de décollement de rétine
La rétine possède une area centralis
Pathologies oculaires spontanées
Mutations spontanées similaires à celles de l'homme
Taille de l'œil
Possibilité d'évaluer le comportement visuel par des tests fonctionnels
Nombreux modèles spontanés caractérisés de maladies oculaires
Facilité de générer des modèles par manipulation génétique
Reproduction rapide et nombre important d'animaux
Existence d'instruments d'évaluation visuelle et morphologique adaptés
Génome séquencé
Importantes données sur les modèles
Étude possible de l'angiogenèse rétinienne néonatale
Nombreux modèles spontanés caractérisés de maladies oculaires
Possibilité de générer des modèles par manipulation génétique
Taille de l'œil plus importante que la souris
Reproduction rapide et nombre importants d'animaux
Existence d'instruments d'évaluation visuelle et morphologiques adaptés
Génome séquencé
Similitudes avec l'œil humain : macula, vision binoculaire, structure des vaisseaux rétiniens, cornée
Possibilité d'utiliser des instruments d'exploration clinique
Limitations
Coût
Barrières réglementaires et sociétales à l'utilisation des chats
Tapetum
Génome incomplètement séquencé
Coût
Barrières réglementaires et sociétales à l'utilisation des chiens
Tapetum
Génome incomplètement séquencé
Œil très petit
Difficulté de réaliser des interventions sur l'œil
Ni macula, ni area centralis
Animal nocturne
Rétine très différente de celle des humains
Ni macula, ni area centralis
Animal nocturne, mais certains rats diurnes existent
Manipulations génétiques plus complexes que chez la souris
Coût très élevé
Utilisation très réglementée et limitée
Génome partiellement séquencé
Réaction immune aux protéines humaines
récapitule les principaux avantages et inconvénients des différentes espèces animales utilisées en recherche ophtalmologique. Les modèles animaux générés par les différents chercheurs sont le plus souvent rendus accessibles dans des animaleries qui conservent des embryons congelés, disponibles à la vente. Les chercheurs échangent volontiers entre eux les modèles qu'ils génèrent. D'une manière générale, il est devenu souhaitable – et ce sera probablement obligatoire dans l'avenir – de rendre publics gratuitement tous les résultats des recherches afin qu'ils puissent servir à d'autres. La recherche étant en grande partie financée par des fonds publics, ces résultats doivent bénéficier à tous, comme un bien public partagé pour faire avancer la science ( open science ).
Spécificités de la recherche préclinique et non clinique en ophtalmologie
Trouver le bon modèle animal
En fonction de la question posée, il est important d'utiliser des animaux dont les yeux permettent de répondre à la question. Pour les études de toxicologie, il n'est par exemple pas pertinent d'étudier la toxicité endothéliale cornéenne sur un lapin, dont l'endothélium régénère, ni d'étudier des médicaments qui agissent sur les vaisseaux rétiniens sur le lapin, qui possède une vascularisation rétinienne très réduite. De même, les rongeurs et les lapins sont dépourvus de macula, rendant impossible l'anticipation d'une maculopathie d'origine toxique [69]. Les lapins albinos, souvent utilisés en ophtalmologie, notamment pour le test de référence d'irritation oculaire (test de Draize), sont caractérisés par un déficit en tyrosine kinase, enzyme nécessaire à la synthèse de mélanine. Or, certains médicaments (et par extension certains produits chimiques) peuvent engendrer une toxicité par fixation sur la mélanine et accumulation au niveau de l'épithélium pigmentaire. C'est le cas de la gentamicine, retrouvée en combinaison avec l'indométacine, dans le collyre Indobiotic®.
Dans les études de pharmacologie, il faut également prendre en compte les différences de physiologie entre l'homme et l'animal. Ainsi, même si le lapin présente une perméabilité de la sclère comparable à l'homme, il faut prendre en compte dans toute étude que la fréquence physiologique de clignement des paupières de cette espèce est moindre que celle des hommes, conduisant à un contact plus long d'une substance avec la surface oculaire et donc à plus d'interactions (moindre élimination, davantage de métabolisation et de pénétration). Ces différences peuvent aboutir à une surestimation de l'effet toxique, pouvant gêner le développement d'une molécule thérapeutique intéressante. Il faut donc bien connaître les modèles animaux pour explorer une pathologie.
Adapter la recherche à la taille des yeux
La plupart des animaux de laboratoire sont des rongeurs dont les yeux sont très petits (quelques millimètres). Il faut donc parfois créer des outils ou des dispositifs adaptés à la taille des yeux. Nous citerons comme exemples les lentilles de contact, ou des systèmes d'injection très petits.
Plusieurs systèmes d'exploration dédiés spécifiquement aux animaux de laboratoire ont été développés récemment (OCT, angiographe, laser, etc.) et facilitent les analyses in vivo.
Développer des systèmes d'administration des médicaments permettant d'étudier leurs effets dans l'œil
Chez l'animal, comme chez l'homme, les barrières oculaires limitent la pénétration des médicaments. Il peut être nécessaire de procéder à des développements parfois complexes de systèmes d'administration des médicaments, plus ou moins prolongés, pour évaluer les effets d'une molécule. En effet, les modèles animaux les plus fréquents sont développés sur les rongeurs et l'injection répétée dans des très petits yeux est dommageable. Il faut donc fabriquer des systèmes à libération prolongée, utilisables sur de très petits yeux, et qui n'induisent pas des effets confondants.
Tests fonctionnels
Explorer la vision chez des animaux est complexe et fait appel à des tests objectifs comme des électrorétinogrammes (ERG), mais aussi des tests plus subjectifs comme l'optocinétique, la pupillométrie chromatique, etc. Tous ces tests sont essentiels, mais ils nécessitent un temps d'apprentissage de l'utilisateur pour être fiables et reproductibles.
Une revue détaillée des procédures utilisées en recherche préclinique ophtalmologique est disponible sur le site de l'ARVO (The Association for Research in Vision and Ophthalmology) sous la forme d'un cours digital intitulé « ARVO Online Research Training Eye Vision Techniques» ( https://www.arvo.org/education/online-education/).
Milieux oculaires
La plupart des méthodes analytiques qui permettent de mesurer des protéines, des médicaments, des métabolites, etc. n'ont pas été développées pour les milieux oculaires, mais pour des dosages dans le sang. La transposition directe d'un test commercial sur une matrice oculaire peut induire d'importants biais et des résultats erronés. Il convient donc d'adapter les tests aux milieux oculaires animaux ou humains avant d'effectuer les dosages.
L'utilisation de milieux oculaire reste un outil essentiel pour valider certaines cibles moléculaires ou évaluer l'efficacité d'un traitement chez l'homme.
Méthodes de toxicologie appliquées à l'ophtalmologie
En toxicologie oculaire, les effets indésirables (EI) peuvent avoir différentes origines : 1) EI oculaires d'un médicament appliqué sur l'œil; 2) EI systémiques associés à un traitement oculaire; 3) EI oculaires d'un médicament ou toxique absorbé par voie systémique (orale, cutanée, injection, inhalation). Tout développement de médicament oculaire, comme tout médicament, doit suivre les étapes de toxicologie réglementaire, longues et coûteuses, allant de la toxicité générale aux études de métagenèse, cancérogenèse et de reproduction. Nous ne nous consacrerons dans cette partie qu'aux effets toxiques les plus courants sur la surface oculaire de médicaments topiques.
Modèles évalués par l'OCDE pour la toxicité sur la surface oculaire
Actuellement, très peu de tests sont disponibles pour évaluer spécifiquement les lésions oculaires, en dehors de l'irritation et de la corrosion oculaire. In vivo, ces évaluations peuvent être réalisées via le test de Draize. Cependant, le monde de la cosmétique se doit de le remplacer grâce à la combinaison de modèles alternatifs. En effet, un seul modèle cellulaire ou organotypique ne suffit pas à classer les substances irritantes ou corrosives selon la classification GHS ou Globally harmonized system of classification and labelling of chemicals hazards statements [70] de l'Organisation des Nations Unies (ONU). Voir encadré 5-1
Classification des substances irritantes ou corrosives pour la surface oculaire selon le GHS
Catégorie 1 : dommages sévères et/ou partiellement réversibles ou irréversibles, c'est-à-dire persistant après 21 jours (pouvant aller jusqu'au stroma profond, voire jusqu'à l'endothélium)
Catégorie 2A : dommages complètement réversibles après 21 jours mais persistant au-delà de 7 jours (dommages transcornéens de l'épithélium pouvant aller jusqu'au stroma)
Catégorie 2B : dommages complètement réversibles pendant la période d'observation de 7 jours (dommages superficiels, faible pénétration transcornéenne)
Catégorie non irritant (sans catégorie)
À titre d'exemple, le chlorure de benzalkonium (BAC) est classé catégorie 1 (irritant sévère) et est utilisé comme substance de référence dans plusieurs tests validés réglementairement [71-72-73].
Actuellement, cinq méthodes d'essai in vitro ont été validées scientifiquement par l'OCDE pour remplacer le test de Draize [74 , 75], en combinaison : les tests de viabilité sur épithélium humain reconstruit ( reconstructed human cornea-like epithelium [RhCE]) [76]; le bovine corneal opacity and permeability (BCOP) test (ligne directrice [LD] 437 [77]); l' isolated chicken eye [ICE] test [ 72]); la méthode d'essai de diffusion de fluorescéine [ 78]; et la méthode d'essai d'exposition de courte durée in vitro ( short time exposure [STE] LD 491 [79]). Ces tests sont autorisés en cosmétique car ils utilisent soit des modèles cellulaires 2D ou 3D, soit des modèles organotypiques avec des cornées d'animaux provenant des abattoirs (animaux destinés à la consommation humaine). On notera tout de même l'existence d'autres tests, faisant l'objet de proposition de LD ou ayant été/étant en cours d'évaluation par l'ICCVAM ( Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods ), comme les isolated rabbit eye (IRE) test , le hen's egg test on the chorio-allantoic membrane (HET-CAM) et d'autres que nous détaillerons ci-dessous [ 80].
Cependant, ces tests alternatifs présentent des inconvénients similaires, parmi lesquels figurent l'absence d'évaluation des lésions conjonctivales ou de l'iris, l'absence d'évaluation de toxicités systémiques pouvant faire suite à une exposition oculaire et la possibilité de faux positifs/faux négatifs. Un tableau comparatif des tests d'irritation oculaire évalués par l'OCDE est exposé en annexe 5-1. Une revue des différentes méthodes alternatives pour tester la toxicité des médicaments sur la surface oculaire peut être consultée dans des revues récentes [81]. Également, actuellement aucun test n'est à lui seul capable de distinguer toutes les classes de GHS, ne pouvant évaluer la réversibilité des effets. Beaucoup de modèles sont encore au stade de recherche fondamentale, mais certains sont déjà présentés comme des modèles prometteurs à optimiser [82].
Démarches émanant de l'OCDE
Choisir la combinaison des essais reste compliqué pour couvrir tous les mécanismes de toxicité possibles et pertinents pour un produit donné. Même si l'irritation oculaire reste l'un des effets indésirables les plus fréquents des produits arrivant à la surface de l'œil, n'évaluer que cet aspect reste très restrictif et peut conduire à des dommages graves, handicapants à long terme, découverts après la mise sur le marché. En continuité avec la démarche actuelle en toxicologie qui est de promouvoir des arbres décisionnels, appelés IATA pour integrated approaches to testing and assessment , la toxicité oculaire après exposition locale à un toxique pourrait bénéficier de ces approches et concerner différentes entités physiopathologiques : sécheresse oculaire, glaucome, cataracte, neuropathies, rétinopathies.
Un toxique peut agir via de multiples cascades de signalisation et plusieurs toxiques peuvent déclencher les mêmes voies ou aboutir au même effet clinique. Malgré les limites de l'extrapolation de l'animal à l'homme, cette complexité peut être récapitulée lors de tests in vivo chez l'animal, organisme intégré, entier. Dans le cadre des modèles alternatifs, il est complexe de modéliser l'intégralité des cascades et effets indésirables au sein d'un seul test. Ainsi, afin de caractériser au mieux l'ensemble des mécanismes pouvant être mis en jeu, le principe d'AOP, ou adverse outcome pathways , est actuellement en plein essor, venant en support des IATA [ 83]. Ainsi, partant d'un événement initial/déclencheur, les AOP simplifient les processus biologiques en une cascade d'événements clés moléculaires et cellulaires qui aboutissent à l'effet néfaste au niveau de l'organe puis de l'individu.
Les AOP ont été conçus comme des structures conceptuelles, souhaitant faire le lien entre le développement d'un produit et sa soumission aux agences réglementaires. Ils participent à promouvoir les alternatives à l'expérimentation animale, puisqu'ils essaient de révéler un ensemble d'événements clés, indispensables pour aboutir à l'AOP, et testables via une combinaison de modèles in silico et in vitro (fig. 5-1
Fig. 5-1Structure séquentielle d'un AOP (adverse outcome pathways), faisant le lien entre un événement moléculaire initiateur et un effet néfaste clinique chez l'homme.
D'après [83].
).
Application à la sécheresse oculaire induite par un toxique
Pour l'évaluation réglementaire de la toxicité d'un composé sur la surface oculaire, l'introduction de la notion de sécheresse oculaire induite par un toxique, ou toxicity-induced dry eye (TIDE) en anglais, comme un critère d'effet indésirable est fondamentale pour distinguer une toxicité en amont de l'irritation oculaire, et en amont de la survenue de symptômes et de signes chez le patient. Partant de l'exemple des ammoniums quaternaires comme le chlorure de benzalkonium (BAC), fréquemment retrouvé dans les collyres en tant que conservateur et de toxicité connue, une cascade d'effets indésirables (AOP) du TIDE a été définie. Cette cascade est composée de différents événements clés ou key events (KE) : modification de la composition du film lacrymal et de son osmolarité, altération des épithéliums conjonctival et cornéen (perte de fonction des jonctions serrées – ZO, claudines, etc.) avec la production d'enzymes protéolytiques (MMP), de cytokines pro-inflammatoires, atteintes de l'innervation de la surface oculaire (comme l'activation de TRPM8, récepteur au froid impliqué dans le réflexe lacrymal) [84-85-86-87]. Ces événements constituent la cascade d'événements indésirables du TIDE (fig. 5-2
Fig. 5-2Proposition de cascade d'effets indésirables (AOP) pour le toxicity-induced dry eye (TIDE), fondé sur l'exemple des composés ammoniums quaternaires. À chaque étape de l'AOP sont présentés des événements indésirables génériques avec des exemples de cibles pouvant être étudiés entre parenthèses.
).
Partant ensuite de cet AOP, une IATA envisageable a été décrite si des modèles de conjonctive associée à des glandes lacrymales, de cornée et d'innervation de la surface oculaire étaient caractérisés respectivement en termes de composition/osmolarité du film lacrymal et de phénotype (protéines des jonctions serrées, enzymes protéolytiques, marqueurs neuronaux). Sur ces modèles, des analyses sont envisageables par des méthodes classiques standardisées (dosages multiplex) ou moins répandues dans le domaine de la recherche ( TearLab Osmolarity System ® – dispositif capable de mesurer l'osmolarité sur 1 μl d'échantillon de larmes humaines [ 88 , 89]). Ces modèles devront cependant être préalablement validés par des études de reproductibilité avec l'évaluation de nombreux composés (contrôles positifs comme le BAC et négatifs comme du PBS).
Fig. 5-3Stratégie intégrée de tests (IATA ou integrated approaches to testing and assessment) proposé pour anticiper le toxicity-induced dry eye (TIDE) via le recours à des modèles alternatifs. La partie 3 est construite sur un état de l'art qui se devra d'être validé réglementairement. Du fait de la complexité de la pathologie, les tests choisis doivent être conduit sur au moins deux systèmes différents (par exemple cornée et film lacrymal) et doivent évaluer au moins trois caractéristiques différentes (par exemple cytotoxicité et composition du film lacrymal). BAC : chlorure de benzalkonium.
, comprendrait, comme toutes les autres, des étapes préliminaires fondées sur une revue de la littérature (dont les AOP pour établir les mécanismes d'action quand ces derniers auront pris plus d'ampleur) et d'acquisition de données physicochimiques – les connaissances sur des familles de molécules avec la même structure et/ou appartenant à la même famille pharmacologique pouvant orienter l'industriel (coût des tests/probabilité de toxicité). Par exemple, toutes les structures comportant des ammoniums quaternaires comme le BAC doivent être des signaux d'alarme pour l'anticipation d'un syndrome sec. Les études in silico vont aussi devenir de plus en plus importantes pour évaluer le passage des barrières de l'œil et le temps de résidence du composé au niveau de la surface oculaire avant toute expérimentation. Ces modèles devront être mis en place en fonction des données de la littérature, mais pourraient bénéficier de nouvelles données grâce aux modèles en microfluidique prenant en compte le flux lacrymal notamment [ 90 , 91].
Enfin, des approches récentes pourraient venir compléter l'IATA, les approches omiques, comme la lipidomique, c'est-à-dire l'analyse du profil lipidique des différentes structures de la surface oculaire par spectrométrie de masse. En effet, participant à la fonction barrière des épithéliums conjonctival et cornéen, les lipides font également partie des métabolites primaires, impliqués dans les voies métaboliques indispensables à la survie cellulaire. Ainsi, des modifications de leur profil (KE) ont été constatées dans plusieurs pathologies de la surface oculaire [92 , 93], dont la sécheresse oculaire. Dans cette maladie, deux catégories de lipides peuvent être analysées : ceux entrant dans la composition du film lacrymal (modification de composition évaluée après exposition toxique dans un modèle de co-culture de conjonctive et glandes); et ceux entrant dans la composition des membranes des cellules épithéliales (analyse de la composition lipidique de culture cellulaires cornéennes et/ou conjonctivales). Certains céramides, notamment, ont été rapportés comme augmentés dans un modèle cornéen in vitro de sécheresse oculaire [94]. Les céramides font actuellement l'objet de recherches poussées, ayant des propriétés pro-inflammatoires (activation de MAPK et synthèse d'IL-1β) et pro-apoptotiques (activation des caspases).
Conclusion
La recherche préclinique et non clinique sont indispensables au développement puis à la surveillance des médicaments après mise sur le marché. La figure 5-4
Fig. 5-4Les grandes étapes du développement préclinique.
résume les grandes étapes de la recherche préclinique qu'il convient de franchir avant d'envisager des essais chez l'homme.
De nombreuses méthodes et divers modèles peuvent être utilisés. Dans le cadre de recherches académiques, de multiples approches complémentaires sont développées pour apporter la démonstration la plus complète que la molécule testée ou la cible thérapeutique découverte présente un intérêt. Les mécanismes d'action sont le plus souvent explorés. Quand les molécules parviennent à un stade plus avancé de développement, les expériences sont plus réglementées et le plan de développement, en particulier le plan toxicologique, peut être discuté en amont avec les agences réglementaires pour parvenir plus rapidement à une autorisation d'essai chez l'homme. Quand les thérapies sont très innovantes, il faut construire avec les agences les recommandations de développement du médicament. Avant de passer à des essais cliniques, des étapes de production du médicament en condition réglementée, des études de stabilité et de conditionnement et enfin la production d'un lot clinique doivent être réalisées. Les études de toxicité doivent être réalisées dans des conditions réglementées et répondre à des exigences spécifiques avant que des essais cliniques ne soient autorisés. Ce n'est qu'au travers de collaborations entre la recherche fondamentale, la recherche préclinique et le développement que peuvent émerger de nouveaux médicaments.
Annexe 5-1. Tableau comparatif des tests d'irritation oculaire évalués par l'OCDE
Pas de données suffisantes sur les champs d'application réduits
*Valeurs données dans les LD de l'OCDE pour identifier les substances de catégorie 1 ou non classées (selon l'applicabilité du test) par rapport au test d'irritation oculaire de Draize.
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