Il est toujours souhaitable que l'ophtalmologiste puisse informer le microbiologiste de vive voix, mais il doit, de toute façon, toujours veiller à renseigner de manière scrupuleuse la feuille de demande qui aura été établie au préalable de manière conjointe entre les différents partenaires. Le clinicien doit y mentionner, outre la date et l'heure du prélèvement, la description précise des circonstances de survenue, les symptômes et les signes, si possible en s'aidant d'un schéma de la localisation et de l'aspect de la lésion, notamment en cas de kératite. Enfin, il doit proposer une priorisation initiale des tests à engager en fonction de tous ces éléments et des résultats de son examen clinique ainsi que ceux des examens d'imagerie (microscopie confocale in vivo par exemple).

Les prélèvements de la surface oculaire à visée microbiologique, essentiellement écouvillonnages et grattages, sont présentés dans le tableau 6-1 . En fonction de la pathologie, les sites de prélèvements, les méthodes de prélèvements et les modalités de transport y sont détaillés. Ces prélèvements doivent, dans la mesure du possible, être réalisés avant toute antibiothérapie et imposent le port de gants non poudrés [1]. La confection d'un kit de prélèvement préparé à l'avance est conseillée pour simplifier et standardiser les procédures (fig. 6-1 ) [2].

Les prélèvements de cornée doivent bénéficier au préalable d'un rinçage de la surface oculaire à l'aide d'une solution de NaCl 0,9 % stérile afin d'éliminer toute trace de fluorescéine et d'anesthésiant qui interféreraient avec les performances analytiques (comme l'inhibition des PCR ou polymerase chain reaction ) [3]. Les grattages de cornée sont effectués par l'ophtalmologiste, sous contrôle de l'épaisseur cornéenne à la lampe à fente. Pour la recherche bactériologique, l'ordre des prélèvements dépend de l'aspect de la lésion cornéenne. En effet, en cas d'ulcère ou d'abcès, on commencera par un prélèvement à l'eSwab®; en revanche, en présence d'un infiltrat sous-épithélial, il est préférable de débuter par un grattage à la lame de bistouri 15T, étalé ensuite en couche mince sur les deux lames cerclées. Il est recommandé de gratter la lésion cornéenne en partant du centre vers les berges, en veillant à éviter tout contact avec les tissus environnants, conjonctive ou paupières [2]. Aucune toilette du visage et des yeux, a fortiori aucun maquillage, ne doit être effectuée avant des prélèvements conjonctivaux.

Tout prélèvement doit parvenir au laboratoire le plus rapidement possible accompagné de sa feuille de demande dûment remplie. Tout délai doit être anticipé, et il est de la responsabilité du biologiste de définir les conditions de transport et de conservation adéquates. Les écouvillons sont transportés à température ambiante, à sec dans leur dispositif initial de transport ou dans des milieux de transport liquides pour les écouvillons de type eSwab®. L'ensemencement des écouvillonnages se fait au laboratoire. La lame de bistouri, destinée à la recherche d' Acanthamoeba par PCR, est transportée en tube stérile ( DNA free ) (voir tableau 6-1 ). Des étalements en couches minces du grattage cornéen sur deux lames en verre cerclées sont réalisés par l'ophtalmologiste. Ces lames seront transportées dans un porte-lame. Les prélèvements liquides, comme les ponctions à l'aiguille montée sur une seringue, sont envoyés au laboratoire directement dans la seringue dont l'aiguille aura été préalablement enlevée. En outre, il est important de savoir respecter les conditions d'anaérobiose si le prélèvement doit arriver au-delà de 2 heures en utilisant un dispositif de transport adapté [ 1 , 4]. Les biopsies, ainsi que les lentilles de contact, d'éventuels corps étrangers, cils, parasites (filaires) sont acheminés dans un tube stérile contenant un peu de solution saline isotonique stérile.

Les étalements du prélèvement sont effectués soit par le clinicien dans le cadre de la kératite, soit au laboratoire (conjonctivites, collections et pus) et sont ensuite colorés pour une recherche et une orientation rapide du ou des pathogène(s). La première coloration utilisée pour la recherche de pathogènes est la coloration de May-Grünwald-Giemsa (MGG) (tableau 6-2 ). Le temps dans le Giemsa est volontiers prolongé à 25 minutes et on parle alors de MGG lent, pour permettre la coloration des kystes d' Acanthamoeba et des filaments mycéliens (fig. 6-2A, B ). Compte tenu de l'hétérogénéité des étalements, il est recommandé de colorer d'emblée les deux lames de grattage cornéen au MGG. Ensuite, d'autres colorations sont envisagées, Gram, Ziehl, Gomori-Grocott (voir tableau 6-2 ) en fonction des orientations issues de ce premier examen, soit sur la deuxième lame, soit sur une lame précédemment colorée au MGG après décoloration de celle-ci à l'alcool à 70°.

Les prélèvements doivent être ensemencés au laboratoire le plus rapidement possible, en tenant compte à la fois de la clinique et des pathogènes les plus fréquemment rencontrés dans les infections de la surface oculaire (hors virus) (tableau 6-3 ). Ainsi, ils sont ensemencés sur des milieux gélosés ou liquides/bouillons riches, tels qu'une gélose chocolat Polyvitex® permettant la culture de bactéries exigeantes et à croissance lente ( Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae , etc.) ainsi que de champignons, une gélose au sang, un bouillon liquide type Schaedler désoxygéné pour l'isolement de bactéries anaérobies, un milieu Lowenstein-Jensen si une mycobactérie est suspectée, et un milieu Sabouraud avec antibiotiques pour isoler les levures et les champignons filamenteux [5].

Les différents milieux de culture ensemencés sont incubés à différentes températures et atmosphères pendant une durée de 7 jours pour les bactéries classiques, voire de 30 jours en cas de suspicion de mycobactéries atypiques et de champignons. Les cultures doivent être observées quotidiennement pendant la durée d'incubation. Au-delà de ces délais, sans prolifération, la culture est considérée comme négative. À l'inverse, en présence d'une culture positive, confrontée à l'examen microscopique et aux données cliniques, il est procédé à une identification bactérienne et à des tests de sensibilité aux antibiotiques.

Dans le cas de kératite sur port de lentilles de contact, une recherche complémentaire d' Acanthamoeba est possible à partir des lentilles de contact ainsi que du liquide contenu dans le boîtier de lentilles, après centrifugation. La culture d' Acanthamoeba est techniquement complexe et n'est pas couramment effectuée dans les laboratoires. Elle est faite en flasques dans du NaCl à 0,9 % enrichi d'une suspension d' Escherichia coli morts [6] en atmosphère humide à 30 °C de 10 à 21 jours, examinée quotidiennement au microscope inversé. Enfin, après 2 ou 3 jours, les amibes forment généralement des kystes visibles [7].

Les pathogènes isolés en culture (bactéries, levures ou champignons filamenteux) font l'objet d'une étude phénotypique en testant une gamme d'antibiotiques ou d'antifongiques pour déterminer leur profil de sensibilité permettant une réadaptation du traitement anti-infectieux initial. Différentes méthodes existent utilisant soit la diffusion en milieux gélosés d'antibiotique à partir de disques ou de bandelettes « E-test» imprégnés, soit la détermination en milieux liquides par microdilution, selon les recommandations des sociétés savantes EUCAST-CA SFM (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing-Comité de l'antibiogramme de la Société française de microbiologie) ou CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute).

Sans attendre les résultats de ces tests de sensibilité, un traitement empirique à large spectre, fondé sur des données épidémiologiques, est débuté immédiatement après que les prélèvements ont été faits. Ce traitement de première ligne est amené à être modifié en fonction des résultats des analyses microbiologiques incluant les tests de sensibilité. Cette réadaptation permet d'utiliser des molécules à spectre moins large, ce qui réduit le risque d'apparition de résistance, en même temps qu'elle permet un ajustement des concentrations efficaces à moindre toxicité. Les voies d'administration de ces traitements des infections de la surface oculaire sont le plus souvent topiques, plus rarement systémiques pour les cas les plus graves. Les agents topiques sont instillés directement sur la conjonctive et la surface cornéenne et sont ainsi immédiatement disponibles, mais ils sont rapidement dilués par les larmes et drainés par le système lacrymal. Des formulations concentrées en agents anti-infectieux (antibiotiques et antifongiques) ou « collyres fortifiés» fabriqués en pharmacie hospitalière sont parfois nécessaires.