Pour bien appréhender l'exploration de la microscopie spéculaire, il convient de rappeler le principe de la réflexion spéculaire [1 , 2]. Celle-ci se définit sur le plan optique lorsque l'angle de réflexion est égal à l'angle d'incidence (fig. 17-1). Ces conditions optiques particulières permettent la visualisation de l'endothélium cornéen. L'indice de réfraction de la couche endothéliale est supérieur à celui de l'humeur aqueuse (1,336) avec une réflectance de 0,22 % de la lumière projetée, permettant ainsi une bonne visualisation des cellules endothéliales [3]. Un angle de 40 à 45° entre la source lumineuse et le biomicroscope (ou autre caméra) permet la meilleure visualisation de l'endothélium cornéen. Selon le grossissement, nous pouvons analyser de manière macroscopique et microscopique. Tous les appareils dérivent de celui décrit par Maurice en 1968 [4].

La microscopie spéculaire est un examen optique non invasif, précis, reproductible et délégable. Il existe deux versions de microscopie spéculaire, la version contact et non contact.

Nous utilisons exclusivement la version non contact actuellement en pratique clinique. Tout appareil de microscopie spéculaire est fondé sur le principe de réflexion spéculaire, avec une source lumineuse orientée selon un angle précis et une caméra permettant l'enregistrement des clichés en fort grossissement de l'endothélium cornéen. Les espaces intercellulaires apparaissent sous forme de lignes sombres qui dessinent les contours cellulaires. Cette image acquise permet ensuite un traitement semi-automatisé de reconnaissance des cellules endothéliales pour ensuite déterminer les paramètres quantitatifs de l'endothélium. Ainsi, nous avons une analyse qualitative et quantitative des cellules (fig. 17-2). L'analyse qualitative permet de voir la taille, la forme, l'agencement des cellules endothéliales entre elles.

Sur le cliché, l'algorithme de l'appareil de microscopie spéculaire va réaliser une reconnaissance semi-automatisée des cellules endothéliales en délimitant le noyau cellulaire et les contours des cellules. Cette partie est dite « semi-automatisée», car il conviendra de revoir les clichés et de vérifier la bonne reconnaissance des noyaux cellulaires ainsi que la bonne délimitation des bords cellulaires. En cas de mauvaise reconnaissance ou de reconnaissance insuffisante, cette correction sera faite manuellement avant de procéder à l'analyse quantitative (fig. 17-3). Cette partie peut être fastidieuse, mais est indispensable pour avoir une analyse quantitative la plus précise possible. La densité endothéliale peut être mesurée et surveillée au fil du temps.

Les limites de la réalisation d'une microscopie spéculaire sont principalement un trouble de la transparence cornéenne, une absence d'ouverture palpébrale suffisante, une coopération insuffisante et une déformation cornéenne trop importante empêchant la réalisation du principe de réflexion spéculaire.

Comme dans toutes les explorations cornéennes et plus largement ophtalmologiques, l'acquisition se fait à travers les différentes couches rencontrées depuis le film lacrymal jusqu'à l'endothélium cornéen en passant par l'épithélium cornéen et le stroma cornéen. Ainsi, un film lacrymal de mauvaise qualité entraînera inéluctablement des clichés de microscopie spéculaire de mauvaise qualité. Il faut penser à faire bien cligner le patient avant l'acquisition et/ou lubrifier l'œil. De même, une taie cornéenne empêche la réalisation de microscopie spéculaire dans la zone de la cicatrice. Néanmoins, celle-ci peut être réalisée dans les autres secteurs.

Les autres limitations viennent essentiellement de la reconnaissance des cellules endothéliales par l'algorithme de l'appareil. Il existe de nombreuses erreurs de reconnaissance prenant des espaces intercellulaires pour des cellules, entraînant ainsi une surestimation du nombre de cellules endothéliales ou, a contrario, une absence de reconnaissance cellulaire, entraînant ainsi une sous-estimation du nombre de cellules endothéliales.

Pour limiter les sources d'erreurs, il convient de respecter plusieurs règles depuis la réalisation de clichés jusqu'à la reconnaissance des cellules endothéliales. Les conditions d'acquisition doivent être optimales et, si besoin, il convient de refaire les clichés. Il faut impérativement réaliser des clichés centraux et des quatre quadrants pour chaque œil. Ensuite, les clichés doivent être validés et la reconnaissance cellulaire minutieusement vérifiée et, si besoin, corrigée pour obtenir l'analyse quantitative la plus précise possible.

Avant de parler de microscopie spéculaire et d'analyse endothéliale, il convient de rappeler l'anatomie et la particularité de l'endothélium cornéen. Il s'agit d'une couche monocellulaire, avec des cellules de disposition hexagonale. Cette disposition est optimale pour la répartition et le bon fonctionnement cellulaire. Ainsi, chaque cellule se retrouve au contact d'une autre cellule sur ses six côtés. Le capital endothélial est définitif et sa densité décline tout au long de la vie. Pour rappel, la densité endothéliale est de 5000 à 6000 cellules/mm ² à la naissance pour passer à 2500 cellules/mm ² à l'âge adulte. La densité cellulaire diminue globalement de 0,6 % par an [5]. Des facteurs intrinsèques et extrinsèques peuvent influer sur la densité cellulaire, comme les facteurs géographiques, ethniques, etc.

Il est également important d'avoir en tête qu'un dommage endothélial provoque un comblement par les cellules résiduelles, entraînant une perte de la densité cellulaire et une modification de la morphologie cellulaire.

Le système d'analyse de la microscopie spéculaire est automatisé mais il est important de garder en tête que ce système est efficace si la qualité de l'image est optimale, et nécessite une analyse manuelle si la qualité est insuffisante, ce qui est souvent le cas. Il est donc impératif de réaliser l'examen de microscopie spéculaire selon un protocole standardisé, en connaissant parfaitement l'appareil, idéalement par un technicien entraîné et qui a l'habitude de réaliser l'examen fréquemment. La variabilité interobservateur est inférieure à 6 % si la qualité de l'acquisition est optimale, et est entre 6 % et 11 % en cas de qualité moyenne [6].

L'analyse de la microscopie spéculaire se fait selon plusieurs critères objectifs, quantitatifs et reproductibles [7]. Nous utilisons principalement quatre paramètres : la surface cellulaire, la densité cellulaire, le polymégathisme et le pléomorphisme (tableau 17-1). La surface cellulaire exprimée en μm ² est la surface des cellules endothéliales. La densité cellulaire exprimée en cellules/mm ² est le nombre de cellules par unité de surface. Le polymégathisme est la variation de la surface cellulaire. Le pléomorphisme est la variation du caractère hexagonal des cellules endothéliales.

Les indications de la microscopie spéculaire sont nombreuses et serviront en dépistage, en diagnostic ou en suivi d'un patient sain et/ou atteint d'une affection cornéenne, et tout particulièrement endothéliale. La principale indication est la dystrophie endothéliale de Fuchs. Il s'agit d'une modification de la membrane de Descemet avec apparition de gouttes (fig. 17-4). Ce changement intervient au début au centre de la cornée. L'indication de la microscopie spéculaire dépend de la symptomatologie fonctionnelle du patient et de l'examen clinique, notamment à la lampe à fente à très fort grossissement. Globalement, il faut retenir que le risque de décompensation de la cornée précoce ou retardée peut intervenir si la densité endothéliale est inférieure à 1000 cellules/mm ² [8]. Ainsi, la microscopie spéculaire est utilisée pour le suivi et la quantification de la perte cellulaire (fig. 17-5).

Les autres dystrophies nécessitent également une analyse en microscopie spéculaire comme la dystrophie cornéenne postérieure polymorphe ( posterior polymorphous corneal dystrophy [PPCD]), la dystrophie endothéliale congénitale héréditaire, les syndromes ICE (irido-cornéo-endothéliaux), avec les syndromes de Chandler, de Cogan-Reese, ou encore d'atrophie essentielle de l'iris. Il existe une classification de ces dystrophies en microscopie spéculaire selon Hirst [9].

La microscopie spéculaire est également indiquée dans les atteintes secondaires entraînant un risque de réduction cellulaire et une modification de la morphologie endothéliale. Ainsi, toute chirurgie endoculaire, avec la chirurgie de la cataracte au premier plan, peut entraîner une atteinte endothéliale. Les autres situations cliniques sont la pseudo-exfoliation capsulaire, le diabète, l'insuffisance rénale avec hémodialyse, médicamenteuse, inflammation intraoculaire type uvéite, ou le port de lentilles de contact, etc.

La microscopie spéculaire est aussi utilisée de manière systématique dans les banques de cornée. En effet, il existe une procédure routinière d'évaluation endothéliale de tout greffon. L'évaluation se fait en central et en plus large champ avec le système non contact. L'évaluation doit se faire de manière standardisée avec des conditions strictes, notamment la température du greffon à 25 °C. Le critère d'éligibilité du greffon est au minimum de 2000 cellules/mm ² .