Différentes techniques utilisant le principe de l'interférométrie, de la réflectance ou encore de la tomographie en cohérence optique (OCT) peuvent être utilisées pour mesurer l'épaisseur totale du film lacrymal. Les auteurs ont ainsi retrouvé des épaisseurs allant de 3 à 6 μm chez les sujets normaux et aux alentours de 2 μm chez les sujets atteints de sécheresse oculaire. Certains ont suggéré une valeur limite d'épaisseur du film lacrymal de 2,75 μm qui aurait une sensibilité de 86 % et une spécificité de 94 % pour le diagnostic de sécheresse oculaire [3].

Le ménisque des larmes correspond au réservoir concave de larmes situé au niveau des marges palpébrales supérieures et inférieures. La plus grande partie du film lacrymal se situe au niveau du ménisque lacrymal, dont la mesure représenterait un bon indicateur du volume lacrymal total. Sa hauteur, son rayon, sa profondeur, sa surface, son volume ou encore sa courbure ont été mesurés avec des techniques variées comme la lampe à fente, la vidéokératographie, la vidéoméniscométrie en réflexion spéculaire, l'interférométrie, et en OCT (fig. 23-1 ) [1 , 2 , 4]. Pour certains auteurs, une diminution de la hauteur et du rayon du ménisque lacrymal inférieur serait un bon indicateur de sécheresse oculaire, avec des valeurs seuil de 1,64 mm et de 1,82 mm, respectivement [5]. Les études les plus récentes utilisant la technique d'OCT-SD ( spectral domain ) ont également montré une bonne corrélation entre les paramètres d'évaluation du ménisque des larmes et les paramètres cliniques, comme le test de Schirmer ou le BUT. Cependant, à la différence du test de Schirmer qui mesure aussi une partie de la sécrétion réflexe, la hauteur du ménisque des larmes ne représente que le volume basal des larmes. Ces techniques ont aussi été utilisées pour évaluer l'élimination de collyres instillés dans les culs-de-sac conjonctivaux, ou encore l'efficacité de traitements comme l'occlusion des points lacrymaux.

La couche lipidique superficielle du film lacrymal peut être observée et mesurée par interférométrie . L'aspect des interférences générées par réflexion spéculaire d'une lumière sur la couche lipidique du film lacrymal préoculaire fournit des informations intéressantes concernant l'épaisseur de la couche lipidique, sa répartition et sa stabilité (fig. 23-2 ). Différents appareils, utilisés isolément (Tearscope®) ou intégrés à des plateformes d'exploration (Lipiview®, Lacrydiag®), ont été développés pour analyser l'aspect des interférences [2 , 6]. Plusieurs classifications des anomalies observées ont également été proposées. La classification de Guillon [1 , 7] qui utilise le Tearscope Plus® est subdivisée en dix niveaux différents (tableau 23-1 ). Les niveaux les plus élevés ont été retrouvés de manière prédominante chez les nouveau-nés et les enfants, témoignant d'une couche lipidique épaisse [7].

Une limite majeure de cette technique reste néanmoins la très grande variabilité des aspects normaux, les aspects anormaux étant uniquement situés aux extrêmes de cette classification, que sont l'absence de lipides ou une épaisseur augmentée avec un aspect globulaire.

Une amélioration de l'analyse des interférences a été proposée en utilisant des enregistrements vidéo de la répartition du film lacrymal et de ses aspects, ou en offrant des graphiques assistés par ordinateur colorés en fonction de l'épaisseur de la couche lipidique. Des études dynamiques de la couche lipidique du film lacrymal après le clignement montrent, chez le sujet normal, une stabilisation complète en moins d'une seconde après une propagation d'aspect horizontal. Dans des cas de dysfonctionnements meibomiens ou dans les cas de déficits aqueux , le temps pour atteindre un film lacrymal stable est beaucoup plus long, de plusieurs secondes ou plus, et l'aspect de la propagation est vertical et inégal, avec une couche lipidique plus épaisse en cornée inférieure et plus mince, déficiente, en cornée supérieure [2].

Toutes ces techniques sont utiles pour étudier de manière non invasive le film lacrymal et particulièrement sa composante lipidique, son épaisseur à l'aide de mesures qualitatives et semi-quantitatives, sa dynamique juste après le clignement, et sa stabilité dans le temps. Cependant, le potentiel discriminatif de ces tests est encore limité par le chevauchement entre les aspects normaux et ceux retrouvés dans des yeux secs modérés. Ces techniques doivent donc être intégrées dans une évaluation clinique complète de la surface oculaire incluant en particulier les glandes de Meibomius. Ces dernières sont analysées cliniquement, mais aussi en meibographie à infrarouge ou encore en OCT.

Les sécrétions des glandes de Meibomius sont des composantes intrinsèques du film lacrymal et jouent un rôle majeur dans la stabilisation du film lacrymal entre chaque clignement. Les dysfonctionnements des glandes de Meibomius sont une cause fréquente d'instabilité du film lacrymal et un des mécanismes principaux du syndrome sec par évaporation. Les techniques de meibographie ont été développées pour étudier la morphologie des glandes de Meibomius et leur contenu [2]. Un test par transillumination est utilisé dans ce but et peut identifier une perte partielle ou totale des structures visibles des glandes de Meibomius. L'atrophie de ces glandes est souvent marquée par des irrégularités du bord libre, l'obstruction par un gonflement localisé ou étendu de la marge palpébrale, mais ces signes manquent de sensibilité et la meibographie peut être utile pour mieux analyser l'aspect des glandes de Meibomius (fig. 23-3 ).

Un des rôles majeurs du film lacrymal est de lisser la surface cornéenne et d'offrir une interface air-cornée aussi régulière que possible [2]. Des irrégularités du film lacrymal résultant de zones de sécheresse, d'une augmentation de l'épaisseur ou d'une surface irrégulière du film lacrymal pourraient affecter de manière importante les qualités optiques entraînant des aberrations optiques et une mauvaise qualité visuelle. De nombreuses techniques et méthodes peuvent être utilisées pour analyser la surface du film lacrymal et les différents types de rupture qui peuvent se produire, la rupture entre deux clignements étant multifactorielle et ne se résumant pas à une simple évaporation [8].

La technique de vidéokératographie a montré que les indices les plus importants de la surface oculaire, l'index de régularité de surface (SRI) et l'index d'asymétrie de surface (SAI), sont très atteints dans les syndromes secs, et que la rupture du film lacrymal, à la fois d'un point de vue temporel (rupture initiale) et dynamique (poursuite de la rupture après la modification initiale), pouvait constituer un indice important et fiable, le NIBUT ou non-invasive break-up time . Un atout très intéressant de l'évaluation du NIBUT est l'enregistrement vidéo de la dynamique du film lacrymal. Le vidéokératographe repère et marque l'ensemble des zones de rupture sur l'image de projection des disques de Placido ainsi que sur la carte codée par couleur selon l'importance et la localisation des ruptures du film lacrymal, puis établit une courbe d'évolution des zones de rupture du film lacrymal (fig. 23-4 ). L'intérêt majeur est d'avoir le profil dynamique et la localisation des zones de rupture du film lacrymal, et pas uniquement l'évaluation quantitative du temps de première rupture et du temps moyen de l'ensemble des ruptures. En effet, on peut admettre qu'une rupture plus ou moins précoce mais stable a un impact différent de celui d'une rupture qui s'étend.

De plus, on peut imaginer qu'une rupture par spots précoce dès le clignement est un mauvais étalement de l'eau sur une couche mucinique déficitaire, alors que des ruptures qui s'étendent et augmentent seraient plutôt une hyperévaporation.

Le récent développement des analyses de front d'onde utilisant des aberromètres de type Hartmann-Shack a aussi fourni une meilleure compréhension des anomalies optiques résultant d'une déficience du film lacrymal. La rupture du film lacrymal a été reconnue comme entraînant des aberrations de haut degré. Dans l'œil sec aussi, on retrouve une augmentation des aberrations totales et des aberrations de haut degré, spécialement les comas et les aberrations de type sphérique, en vision photopique et scotopique, par rapport aux sujets normaux. Cette technique rend possible une analyse plus fine et une quantification de l'atteinte optique dont se plaignent la plupart des patients aux yeux secs, même en l'absence de kératite superficielle, sachant que les instabilités du film lacrymal entraîneraient aussi des aberrations optiques [9].

Des systèmes mesurant les aberrations optiques et leur variabilité permettent d'identifier les troubles des milieux éventuels mais aussi l'instabilité lacrymale qui crée des variations importantes des indices et donc de la fonction visuelle (fig. 23-5 ).

Le prélèvement des cellules s'effectue traditionnellement à l'aide de filtres ou membranes aux structures et compositions variées, adaptées aux applications ultérieures [1]. Ces filtres sont appliqués sur la conjonctive bulbaire supérieure médiane, une zone choisie pour sa protection par la paupière et la reproductibilité des prélèvements, minimisant ainsi la variabilité environnementale dans les zones exposées. Les filtres en acétate de cellulose ont été les premiers à être utilisés pour des techniques de cytologie classique et nécessitaient une transparisation avant l'observation au microscope. Les filtres en polyéther sulfone sont aujourd'hui largement utilisés pour des techniques de microscopie confocale, de cytométrie en flux ou de biologie moléculaire, tout en permettant également des analyses de cytologie classique sans transparisation.

Un dispositif stérile à usage unique et à bord mousse a plus récemment été introduit sur le marché (EyePrim™, OPIA Technologies SAS). Il permet de standardiser le processus de prélèvement, la membrane stérile en polyéther sulfone étant préinstallée dans le dispositif et appliquée sur l'œil à l'aide d'un piston [10]. Il simplifie le prélèvement, élimine les risques pour le patient, évite l'utilisation de pinces et garantit la stérilité de la membrane.

Trois types de populations cellulaires conjonctivales sont observables sur les empreintes conjonctivales : les cellules épithéliales, les cellules à mucus et les cellules inflammatoires (fig. 23-6, fig. 23-7, fig. 23-8). Jusqu'à récemment, les cellules épithéliales étaient considérées comme des cellules de recouvrement de la muqueuse conjonctivale, sans intérêt biologique, mais des études ont largement démontré leur implication directe dans de nombreux processus biologiques, notamment les réponses inflammatoires et apoptotiques. La cytologie conjonctivale classique permet de coter la métaplasie squameuse selon différentes classifications (tableau 23-2 et voir fig. 23-6 ). L'identification de cellules épithéliales contenant une chromatine en forme de serpent (voir fig. 23-7 ) ou des inclusions intra-épithéliales, ainsi que celle de la présence de cellules non épithéliales provenant des couches profondes de la conjonctive (lymphocytes, cellules dendritiques, éosinophiles; voir fig. 23-8 ) et même d'autres micro-organismes, sont réalisables. L'analyse de ces diverses populations cellulaires – leurs taille, nombre, densité et modifications pathologiques – fournit des informations cruciales sur l'état de la surface oculaire.

Les cellules à mucus libèrent des mucines solubles dans le film lacrymal, jouant ainsi un rôle régulateur et défensif crucial à la surface oculaire. La perte de cellules à mucus caractérise les syndromes secs, tandis que leur présence sur la surface cornéenne est pathognomonique de la conjonctivalisation associée aux déficits en cellules souches limbiques [11]. Le comptage des cellules à mucus semble ne pas être affecté par l'âge, mais des facteurs tels que la répétition des empreintes dans la même zone conjonctivale et le port de lentilles de contact augmentent la densité en cellules à mucus. Cela suggère que la stimulation des cellules à mucus peut intervenir en tant que réponse adaptative précoce à des microtraumatismes ou à des réactions inflammatoires. Cependant, les études portant sur les maladies chroniques de la surface oculaire, tels que les syndromes secs, les conjonctivites chroniques, la rosacée oculaire, l'utilisation prolongée de collyres antiglaucomateux ou le port prolongé de lentilles de contact, indiquent généralement une diminution significative, voire une disparition des cellules à mucus [1].

Les cellules inflammatoires présentes dans les empreintes conjonctivales comprennent principalement les polynucléaires neutrophiles et éosinophiles, les cellules dendritiques reconnaissables par leur forme distinctive et leur immunocompétence, ainsi que les cellules de Langerhans, et diverses populations de lymphocytes localisées dans l'épithélium ou migrant depuis le chorion sous-épithélial. En cas de conjonctivite allergique, l'empreinte peut identifier des éosinophiles évocateurs de réactions allergiques. Parfois, la présence d'acariens ou même d'insectes a été constatée, suggérant une auto-inoculation par les mouvements de grattage. Il est plausible que ces parasites entretiennent et stimulent des réactions inflammatoires locales sévères.

L'utilisation de la technique classique de cytologie conjonctivale reste limitée. Pour surmonter cette limitation, de nouvelles procédures telles que les techniques immunocytologiques ont été développées au cours des 15 dernières années. L'utilisation d'un microscope confocal a rendu possible les techniques d'immunofluorescence directement sur ces empreintes. Une grande variété de marqueurs peut être utilisée pour identifier les cellules épithéliales ou leur activation, ainsi que les cellules à mucus (fig. 23-9 ) et les cellules inflammatoires, notamment dendritiques (fig. 23-10, fig. 23-11).

Néanmoins, ces techniques d'immunocytologie ne permettent pas une quantification fiable des marqueurs d'activation. Ces analyses morphologiques peuvent donc être avantageusement complétées par des techniques de quantification, en particulier par la cytométrie en flux . Cette technique implique l'illumination individuelle de cellules en suspension à l'aide d'un faisceau laser monochromatique de haute énergie. La cytométrie en flux offre une détection sensible, permettant l'analyse des densités cellulaires basses, ainsi que de faibles intensités de fluorescence. En plus de la caractérisation cellulaire, cette technique permet d'explorer les fonctions cellulaires et d'adopter une approche physiologique.

Trois principales pathologies ont pu en bénéficier directement : l'allergie, les syndromes secs et les atteintes toxiques [10]. Des phénomènes immuno-inflammatoires ont ainsi pu être identifiés grâce à des marqueurs tels que l'expression des antigènes de classe II du complexe majeur d'histocompatibilité HLA-DR, l'amplification de molécules d'adhésion, ou la présence de molécules appartenant à la famille des récepteurs au TNF-α (CD40, CD95/Fas), ou à celle des interleukines (IL). Une étude a révélé que la cytométrie en flux peut distinguer les marqueurs des systèmes TH1 et TH2, grâce à la présence des récepteurs aux chimiokines CCR5 et CCR4 respectivement [12]. Parmi ces marqueurs, l'expression de HLA-DR, normalement limitée aux cellules immunitaires, mais surexprimée par les cellules épithéliales en cas d'inflammation induite par le système immunitaire, semble être le facteur le plus pertinent en raison de sa sensibilité élevée, dépendante de l'intensité des réactions inflammatoires, faisant de HLA-DR l'un des meilleurs marqueurs d'inflammation oculaire.

Les techniques de biologie moléculaire appliquées aux empreintes conjonctivales offrent la possibilité d'analyser simultanément plusieurs transcrits sur une seule empreinte, éliminant le besoin de multiples prélèvements pour enrichir le nombre de cellules pour la cytométrie en flux. L'implication de l'IL-6 dans le syndrome sec auto-immun de Sjögren a été identifiée en priorité, mais d'autres cytokines, telles que l'IL-8, le GRO-α, l'IL-1β, etc., ont également été étudiées.

D'autres domaines de recherche incluent l'étude des mucines de la conjonctive ou l'expression génique des enzymes antioxydantes. De même, des empreintes conjonctivales de patients glaucomateux traités avec des analogues des prostaglandines ont montré en RT-PCR ou reverse-transcription-polymerase chain reaction l'induction des métalloprotéinases 1, 3 et 9 (MMP-1, -3, -9) et la réduction de leurs inhibiteurs, tissue inhibitors of metalloprotease 1, 2 (TIMP-1, -2) par ces molécules. De plus, une corrélation a été observée entre les niveaux d'ARN messagers et les profils d'expression de la protéine HLA-DR sur des échantillons conjonctivaux [13].

Actuellement, des méthodes de criblage étendu des transcrits sont disponibles, permettant l'analyse de plusieurs centaines de gènes sur une seule empreinte, utilisant des techniques telles que le microarray ou le NanoString [14]. Comme pour les larmes, le champ d'application des techniques dites « omiques» semble désormais illimité.