La reconstruction de la surface oculaire des yeux atteints de déficit en cellules souches limbiques (DCSL) sévère reste l'un des problèmes les plus difficiles en ophtalmologie. Elle nécessite un ensemble de mesures préopératoires pour préparer les mécanismes de défense de la surface oculaire à la chirurgie, requiert des procédures chirurgicales exigeantes de greffes de plusieurs sortes, et implique une prise en charge postopératoire prolongée qui comprend parfois une immunosuppression et des soins continus pour le maintien de la santé de la surface oculaire. Depuis environ trois décennies, on sait que le DCSL peut être traité par greffe de tissu limbique sain [1 , 2]. En utilisant des méthodes de culture de l'épithélium cornéen, Pellegrini et al. [3] ont été les premiers à montrer en 1997 que de petites quantités d'épithélium limbique pouvaient être cultivées avec des fibroblastes 3T3, et permettre ainsi la greffe d'un tissu épithélial limbique étendu sur l'œil atteint (auto-CLET ou cultivated limbal epithelial transplantation ). Par la suite, des méthodes de culture sur membrane amniotique humaine ou sur fibrine, évitant ainsi les fibroblastes 3T3, ont été utilisées pour traiter le DCSL uni- ou bilatéral. Ce domaine étant encore en évolution et ne touchant que peu de patients, dont les étiologies du DCSL sont très différentes, on sait peu de choses sur les résultats à long terme pour ces patients.
Traitement médical
Lutter contre la iatrogénie
L'utilisation de conservateur est aujourd'hui à proscrire dans les troubles de la surface oculaire [4]. De plus, il est admis que les traitements conservés, lorsqu'ils sont administrés de manière chronique, peuvent également induire des troubles de la surface oculaire jusqu'à l'apparition d'un DCSL, partiel ou total. Quelle qu'en soit l'étiologie, face à une pathologie chronique de la surface oculaire, le premier traitement est l'arrêt de la iatrogénie en arrêtant et en substituant tous les traitements avec conservateur, au premier plan le chlorure de benzalkonium.
Traitements cicatrisants et hydratants
Les substituts lacrymaux sont le deuxième traitement le plus important dans les pathologies de la surface oculaire. Ceux-ci doivent être prescrits de manière orientée pour la pathologie concernée. Dans la prise en charge d'un DCSL, il faut utiliser des traitements hydratants et cicatrisants (hyaluronate de sodium, tréhalose, carboxyméthylcellulose et vitamine B12).
Traitement chirurgical
Le traitement chirurgical ne s'envisage que lorsque l'acuité visuelle est basse, non améliorable avec une correction (lunettes ou lentilles) et les traitements médicaux. Si l'axe visuel n'est pas atteint, avec une acuité satisfaisante pour le patient, il faut savoir s'abstenir. Un essai de lentille cornéosclérale est intéressant avant toute décision chirurgicale, afin d'améliorer l'acuité visuelle et de diminuer la sécheresse de la surface oculaire. Avant d'envisager une reconstruction limbique, la restauration d'une homéostasie de la surface oculaire est indispensable et influencera de manière significative les résultats de la chirurgie. Il faut donc s'assurer que les troubles palpébraux comme les symblépharons et les malpositions palpébrales soient traités, que la pression intraoculaire (PIO) soit bien contrôlée. Il faut aussi vérifier s'il existe une pathologie sous-jacente, et si c'est le cas, que cette dernière soit équilibrée et stable sous traitement depuis plus de 6 mois. Enfin, l'œil ne doit plus être inflammatoire, ce qui justifie d'attendre en moyenne une année après la cause déclenchante, surtout dans les brûlures.
Les différentes techniques [5], décrites dans la figure 72-1
Fig. 72-1Résumé de la prise en charge d'un déficit en cellules souches limbiques.GMA : greffe de membrane amniotique.
, sont listées ci-après et classées selon le tissu greffé : cellules limbiques autogéniques et allogéniques, cellules limbiques cultivées ex vivo et enfin cellules non limbiques cultivées ex vivo. Nous ne reviendrons pas sur la simple greffe de membrane amniotique qui peut toujours être réalisée en tout début de reconstruction si l'on imagine qu'il persiste quelques cellules souches limbiques. Elle peut diminuer des phénomènes douloureux inflammatoires avant toute décision de traitement étiologique. Elle peut également être associée aux techniques de greffes limbiques.
Greffes de cellules limbiques directes, auto- ou allogéniques
Autogreffe conjonctivolimbique
Il s'agit de la technique de choix et la plus utilisée pour les DCSL strictement unilatéraux [1 , 2 , 6]. Elle consiste à prélever environ un quart à un tiers du limbe de l'œil sain controlatéral avec un lambeau conjonctival en regard, et de venir le greffer sur l'œil pathologique en patch supérieur et/ou inférieur ( conjonctival limbal autograft [CLAU]) (fig. 72-2
Fig. 72-2Représentation schématique de la technique d'autogreffe conjonctivolimbique (conjonctival limbal autograft [CLAU]). a-g. Dissection d'un morceau cornéen limbique et conjonctival sur l'œil sain, puis greffe sur l'œil pathologique après avoir enlevé toute la prolifération conjonctivale et vasculaire, et préparé le lit du greffon au niveau du limbe afin d'encastrer ce dernier. Il est suturé avec du monofilament 10/0 sur la cornée et du Vicryl 8/0 sur la conjonctive. Une membrane amniotique peut recouvrir le tout.
Source : dessin de Cyrille Martinet (d'après [2]).
). Il n'y a pas de risque de rejet et les résultats sont excellents. En revanche, cette technique est contre-indiquée en cas d'atteinte bilatérale, ou d'une pathologie inflammatoire ou auto-immune sous-jacente.
Allogreffe conjonctivolimbique
En cas de DCSL bilatéral ou secondaire à une pathologie inflammatoire chronique (syndrome de Stevens-Johnson, pemphigoïde des muqueuses), une allogreffe conjonctivolimbique d'un donneur, apparenté ou non, peut être proposée ( living-related conjunctival limbal allograft [LR-CLAL]). La technique chirurgicale est la même, mais les résultats sont moins spectaculaires, avec des épisodes de rejet immunitaire nécessitant la mise en route d'un traitement immunosuppresseur par voie générale.
Allogreffe kératolimbique
Cette technique est réservée au DCSL bilatéral, ou unilatéral chez un patient ne souhaitant pas utiliser l'œil sain comme donneur. La technique consiste à prélever un contingent cellulaire plus important, sans conjonctive. Elle s'adresse donc à des atteintes purement limbiques, où la conjonctive est respectée (contre-indiquée en cas de pemphigoïde des muqueuses ou de syndrome de Stevens-Johnson). Chez ces patients, nous pourrons proposer une allogreffe combinée conjonctivo-kératolimbique – combined living-related conjunctival limbal allograft (lr-CLAL)/ keratolimbal allograft (KLAL) ou Cincinnati procedure [7].
Les résultats sont bons immédiatement, mais la principale limite est le risque de rejet immunitaire, avec nécessité d'introduire un traitement immunosuppresseur général en postopératoire. Comme dans les allogreffes épidermiques chez les grands brûlés de la peau, elle peut servir à améliorer une atteinte très sévère, transitoirement, et permettre l'utilisation de cellules limbiques cultivées dans un second temps, plus calme.
Le taux moyen de réussite de ces techniques utilisant des cellules limbiques est de 72 % d'après une étude évaluant les résultats avec un recul de 4 ans. La principale complication a été le rejet immunitaire dans les greffes allogéniques et celui-ci était irréversible dans 25 % des cas [8]. La puissance de ces études, faible, doit faire prendre du recul sur les résultats de ces techniques chirurgicales, et chaque centre spécialisé se forge, en général, sa propre expérience. Aucun consensus, sur le plan thérapeutique, ne peut vraiment être rédigé à ce jour. Par ailleurs, la décision de mettre les patients sous immunosuppresseurs par voie générale pendant de nombreuses années doit être prise au cas par cas, car elle peut favoriser ou induire des pathologies tumorales secondairement.
Greffes de cellules limbiques cultivées
Dans ces techniques, le principal frein est le coût. En effet, pour réaliser une culture cellulaire, il faut disposer d'un laboratoire équipé, de techniciens compétents et de moyens financiers. La technique de culture varie d'une équipe à une autre. Les premiers travaux sur la culture cellulaire épithéliale cutanée remontent à 1957 par l'équipe de Rheinwald et Green [9], et son application en ophtalmologie à 1997 par Pellegrini et al. [3]. Depuis, de nombreuses études ont montré l'intérêt et l'efficacité de la culture cellulaire dans la prise en charge du DCSL [10]. La biopsie limbique peut être réalisée sur l'œil controlatéral en cas d'atteinte unilatérale ou asymétrique (le prélèvement est de 1 à 2 mm); on parle d'auto-CLET ( cultivated limbal epithelial transplantation ) . Si l'atteinte est totale et bilatérale, le prélèvement peut être réalisé à partir d'un donneur vivant apparenté; on parle d'allo-CLET. Le substrat le plus souvent utilisé est la membrane amniotique humaine ou la fibrine.
Les deux techniques prédominantes sont :
la technique de l'explant : les cellules sont déposées sur une membrane amniotique désépithélialisée et sont laissées en culture dans un milieu 2 à 3 semaines afin qu'elles migrent sur la membrane;
la méthode de suspension : elle consiste à séparer de manière enzymatique les cellules du greffon. Les cellules individualisées sont ensuite ensemencées sur un support (membrane amniotique ou fibrine [11] – fig. 72-3
Fig. 72-3 a, b. Culture du feuillet épithélial sur de la fibrine que l'on glisse sous la conjonctive pour la maintenir en refermant la conjonctive par deux points de Vicryl 7/0 (flèches) [11].
– ou boîte de culture en plastique avec couche nourricière de fibroblastes par exemple). La culture est laissée 2 à 3 semaines pour obtenir un feuillet conséquent.
Dans une revue de 13 études publiées avec un recul de 2 ans [5], le taux de réussite était estimé à 72 % (89 % des procédures étaient autologues). Le risque de rejet, en cas de greffe allogénique, était estimé à 30 %, mais les protocoles de traitement postopératoire varient beaucoup d'une équipe à l'autre, rendant les résultats difficilement généralisables.
L'alternative, en cas de DCSL unilatéral et en l'absence de laboratoire à disposition, est de réaliser une migration cellulaire in vivo; il s'agit de la SLET ( simple limbal epithelial transplantation ) . Le limbe donneur est divisé en microfragments collés à la surface de la cornée réceptrice. Le maintien de ces petits morceaux de limbe reste cependant un problème, car ils sont impossibles à suturer et la lentille de contact, positionnée en fin de chirurgie, n'assure pas toujours bien leur adhésion.
Greffes de cellules non limbiques, cultivées ex vivo
Les feuillets épithéliaux de muqueuse orale semblent être une voie intéressante en cas d'atteinte bilatérale de DCSL. En effet, outre leur origine autologue qui annule le risque de rejet immunitaire, ces cellules ont la particularité d'être stables en culture. Les premiers travaux (animal et homme) remontent aux années 2000 par l'équipe de Kinoshita et al. [12].
La culture de ces cellules, appelée COMET ( cultivated oral mucosal epithelial sheet transplantation ) , consiste à prélever un greffon de muqueuse orale (6 à 9 mm 2) au scalpel (pour ne pas abîmer les cellules avec un bistouri électrique). Ensuite, les cellules épithéliales sont séparées de la lamina propria en utilisant l'enzyme dispase. Puis, l'épithélium est traité par la trypsine-EDTA pour obtenir une suspension cellulaire. Comme pour la culture de cellules limbiques, la suspension est ensemencée sur un support (membrane amniotique par exemple), puis plongée dans un milieu de culture pour 2 à 3 semaines. Le feuillet doit enfin être décollé de son support avant d'être proposé à la greffe; la méthode diffère selon le support utilisé.
Dans l'étude CAOMECS ( Cultivated Autologous Oral Mucosa Epithelial Cells Sheet ) [13], le support utilisé était un polymère thermosensible qui permettait de décoller facilement le feuillet de son support et de le proposer à la greffe sans suture, maintenu par une lentille de contact souple pendant une semaine. Ce polymère n'est malheureusement plus fabriqué, et nous avons développé au CHU de Lyon un nouveau programme hospitalier de recherche clinique (PHRC) appelé FEMJA (Feuillet épithélial de muqueuse jugale autologue , fig. 72-4
Fig. 72-4Schéma simplifié du protocole FEMJA (Feuillet épithélial de muqueuse jugale autologue; programme hospitalier de recherche clinique [PHRC] en cours, Lyon).Une biopsie jugale est réalisée sous anesthésie locale au scalpel. Le prélèvement est ensuite transmis à la banque de cornée, où une incubation est réalisée avec action de la dispase pour séparer les cellules épithéliales de la lamina propria. La trypsination fractionnée permet d'obtenir une suspension cellulaire qui est mise en culture sur des fibroblastes dermiques humains irradiés pendant 14 jours afin d'obtenir un contingent de cellules épithéliales qui seront enfin décollées par collagénase et proposées à la greffe sur un anneau de polyfluorure de vinylidène (PVDF).
Source : dessin de Cyrille Martinet.
), avec un support propre à la culture des cellules jugales développé au sein de notre laboratoire afin de s'affranchir de tout fournisseur extérieur [14] (fig. 72-5
Fig. 72-5Avant (a) et après (b) la chirurgie d'exérèse du pannus fibrovasculaire conjonctival ayant envahi la cornée malade. Il faut réaliser une kératectomie superficielle pour ne pas perforer (l'épaisseur cornéenne est difficile à évaluer avant la chirurgie), mais suffisante pour avoir une surface la plus régulière possible et retrouver parfois une transparence stromale. Il faut également coaguler tous les néovaisseaux et repousser la conjonctive en arrière du limbe pour glisser sur cette surface parfaite l'épithélium fabriqué en culture. c, d. À 1 mois postopératoire de FEMJA. L'autogreffe de cellules limbiques cultivées a été positionnée et permet de reconstituer quelques assises cellulaires épithéliales de bonne qualité bloquant la repousse des vaisseaux au limbe.
Fig. 72-6Avant chirurgie (a, brûlure) et 6 mois après CAOMECS (b). Le stroma cornéen n'étant pas très atteint, seule la greffe de cellules de la muqueuse orale a permis l'éclaircissement de la cornée et le maintien d'un épithélium de bonne qualité à 6 mois. L'acuité visuelle a progressé.
).
Le taux de succès varie de 57 % à 63 % selon les études [12 , 13]. Le gain d'acuité visuelle est souvent faible, car le stroma de ces patients est volontiers peu transparent et le recours à une kératoplastie pour réhabilitation visuelle (KT ou KLAP) est nécessaire pour obtenir un gain visuel significatif. Le recours à la greffe de cornée n'est pas toujours pris en compte dans les études, limitant encore une fois l'interprétation des résultats. Les complications sont rares, car l'origine des cellules est autologue.
Les principales complications sont inflammatoires, souvent en lien avec une réactivation de la pathologie sous-jacente, ou surviennent en postopératoire de la greffe de cornée (retard de cicatrisation, rejet immunitaire). Le recours à une greffe de cellules de muqueuse orale (buccale ou jugale) permet d'améliorer le résultat et la stabilité d'une greffe de cornée secondaire chez ces patients. Les boutons cornéens trépanés pour la réalisation de greffes stromales montrent l'existence d'un épithélium pluristratifié de bonne qualité reposant sur une membrane basale. L'étude immunohistochimique de cet épithélium révèle la présence de cytokératines 6, marqueurs de l'épithélium de la muqueuse orale, de l'antigène P63, marqueur de cellules souches, et de MUC16, existant habituellement dans les cellules épithéliales conjonctivales [13].
D'autres cellules cultivées ex vivo ont été proposées, dans de nombreuses études, mais les moyens de prélèvements et les résultats n'ont pas abouti à une généralisation de leur utilisation. Il s'agit en particulier des greffes autologues de cellules souches mésenchymateuses, prélevées dans la moelle osseuse ou dans le sang du cordon de bébé. Le feuillet épithélial fabriqué exprime les marqueurs de différenciation cornéenne (CK3) et de cellules souches (P63), témoins du potentiel régénératif de ces greffes [15 , 16]. La greffe autologue du follicule pileux [17], ou de la pulpe dentaire [18], réalisée chez la souris ou le rat, semble donner de bons résultats, mais n'est actuellement pas promue.
Points forts
Le déficit en cellules souches limbiques (DCSL) est une pathologie rare et complexe de la surface oculaire. Son diagnostic est clinique, mais les nombreux pièges et diagnostics différentiels doivent aujourd'hui faire compléter notre bilan par la réalisation d'examens complémentaires tels que la microscopie confocale in vivo ou l'OCT de segment antérieur avec mapping épithélial.
Lorsque le recours à la chirurgie est envisagé, la réalisation au préalable d'une impression cytologique de la cornée permet de confirmer l'atteinte partielle ou totale, et donc de guider le choix de la greffe à proposer. La prise en charge de la surface oculaire dans sa globalité doit être réalisée en amont d'une chirurgie limbique, afin d'optimiser la réussite de cette dernière.
La décision chirurgicale doit toujours faire évaluer le bénéfice par rapport aux risques attendus et être guidée par l'étiologie du DCSL. L'évolution des techniques de cultures cellulaires épithéliales ex vivo permet d'améliorer systématiquement la symptomatologie fonctionnelle oculaire et d'entrevoir un espoir de réhabilitation visuelle chez ces patients en état de cécité légale à la suite d'un DCSL bilatéral et total.
Bien que ces techniques soient coûteuses et soumises à une réglementation sanitaire stricte, variant d'un pays à l'autre, les résultats obtenus doivent nous inciter à poursuivre nos recherches sur la cellule souche idéale qui apportera la meilleure solution thérapeutique.
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