Les cellules de l'EPR ont été générées à partir d'iPSC humaines dès 2009 [6], seulement 2 ans après la découverte des iPSC. Un avantage particulier de ce tissu est qu'il peut être différencié spontanément à partir des iPSC. En effet, suite au retrait du milieu de culture, du facteur de croissance fibroblast growth factor 2 ou FGF-2 (indispensable au maintien de l'état pluripotent des iPSC), des foyers pigmentés apparaissent spontanément dans les plaques de culture d'iPSC (fig. 31-1a). Ceux-ci peuvent être retirés manuellement à l'aide d'un microscope optique, dissociés et remis en culture adhérente pour être amplifiés afin d'obtenir un tissu homogène.

L'EPR dérivé des iPSC (désigné ci-après iEPR) est constitué d'une monocouche de cellules avec une pigmentation (due à la présence de nombreux mélanosomes) visible à l'œil nu (fig. 31-1b). La monocouche est composée de cellules étroitement regroupées présentant une morphologie caractéristique en pavés (fig. 31-1c). Les cellules iEPR possèdent de nombreuses microvillosités sur leur surface apicale et un noyau situé de manière basale (fig. 31-1d), et expriment des marqueurs caractéristiques de l'EPR natif de manière polarisée. On peut citer le marqueur des jonctions serrées zona occludens (ZO-1) sur le côté apical, et la protéine membranaire intégrale Bestrophin-1 sur le côté basolatéral.

Ce qui rend le modèle iEPR particulièrement puissant, au-delà de sa morphologie distinctive, est sa capacité à reproduire les fonctions de l'EPR natif (fig. 31-2), qui peuvent être étudiées séparément à l'aide de divers outils disponibles en laboratoire. Les différentes fonctions de l'EPR telles que le transport épithélial, la sécrétion de nombreux facteurs et la phagocytose des segments externes des photorécepteurs, sont hautement régulées par des canaux ioniques [7]. Le transport des ions à travers la membrane plasmique affecte directement la fonction de l'EPR, et indirectement les concentrations de calcium intracellulaire qui agissent comme messager secondaire. De ce fait, par des études électrophysiologiques et d'imagerie calcique, il a été démontré que l'iEPR possède des canaux fonctionnels identiques à ceux de l'EPR natif [8]. De plus, de nouveaux rôles ont pu être attribués à certains canaux, démontrant que l'iEPR constitue même un modèle puissant pour approfondir les connaissances fondamentales sur les fonctions de l'EPR.

L'iEPR est un épithélium pavimenteux étanche et son étanchéité peut être évaluée en mesurant la résistance transépithéliale ( transepithelial resistance [TER]). Cette étanchéité est attribuable aux jonctions serrées apicales qui peuvent être visualisées en microscopie électronique et à fluorescence grâce à un marquage de la protéine ZO-1 [7]. Une fois l'étanchéité établie, l'iEPR est capable de transporter activement des liquides de manière apicobasale comme un EPR natif. Cela peut être visualisé grâce à l'apparition des vésicules, formations de liquide qui se forment entre l'EPR et le support plastique, puisque le liquide transporté ne peut pas être évacué [9].

De même, l'iEPR est capable de sécréter des facteurs de croissance de manière polarisée, comme le PEDF ( pigment epithelium-derived factor ) du côté apical et le VEGF ( vascular endothelial growth factor ) du côté basal [8]. Pour analyser la polarisation de ces sécrétions, l'iEPR est cultivé en chambres compartimentées et le contenu du surnageant des chambres apicale et basale peut être analysé séparément par un test de dosage d'immunoadsorption enzymatique. De plus, l'iEPR peut effectuer la phagocytose des segments externes des photorécepteurs via ses microvillosités apicales, qui peut être suivie par des techniques d'imagerie et quantifiée de façon précise par des dosages immunologiques. L'iEPR participe activement au cycle visuel suite à l'ajout de rétinol tout- trans recombinant dans le milieu de culture, et les intermédiaires du cycle, tels que les rétinyl ester tout- trans ou le 11- cis rétinal, peuvent être analysés spécifiquement par chromatographie liquide haute performance [10].

Grâce à sa morphologie fidèle et sa fonctionnalité, l'iEPR est donc un modèle très puissant pour étudier différentes DRH affectant l'EPR. L'une des premières maladies à avoir été étudiée est la maladie de Best due aux variants du gène BEST1 . L'étude de l'iEPR de patients a suggéré qu'une dégradation perturbée des segments externes des photorécepteurs suite à la phagocytose, couplée à un stress oxydatif, contribue à la physiopathologie de la maladie [11]. Cette étude a permis d'identifier un rôle pour la protéine Bestrophin-1 , rôle jusqu'alors inconnu, dans la modulation de la libération des stocks calciques du réticulum endoplasmique liée à l'activité d'un canal chlore [12].

Une autre maladie qui a rapidement été modélisée à l'aide de l'iEPR est la choroïdérémie (CHM). En 2014, il a été démontré que l'iEPR de patients atteints de CHM reproduisait le défaut biochimique de la maladie, à savoir la perturbation d'une modification post-transcriptionnelle (prénylation) des protéines Rabs, qui régulent le trafic vésiculaire intracellulaire. De plus, l'iEPR peut être utilisé pour tester l'efficacité de stratégies de thérapie génique utilisant des vecteurs de type AAV ( adeno-associated virus , vecteurs viraux adéno-associés). Le criblage de différents sérotypes de vecteurs AAV a permis d'identifier le sérotype AAV5 comme le plus efficace pour infecter l'iEPR humain [9]. Ainsi, le traitement avec un vecteur AAV5 portant le gène CHM a permis de restaurer la prénylation des protéines Rabs [9]. Les variants non-sens étant responsables d'environ 30 % des cas de CHM [13], une approche thérapeutique prometteuse pourrait reposer sur l'utilisation de molécules capables de permettre la « translecture» de ces variants. Cependant, une étude sur l'iEPR CHM a révélé la complexité d'une application généralisée de ces molécules, leur efficacité variant en fonction du type de codon impliqué et du degré de conservation évolutive de l'acide aminé codé [13]. Ainsi, l'iEPR dérivé de patients pourrait constituer un outil précieux pour un criblage personnalisé, permettant d'identifier les patients susceptibles de bénéficier de ce type de thérapie avant de procéder à des essais cliniques.

L'utilisation d'iEPR dérivés de cellules de patients atteints d'autres DRH a servi pour des études génétiques afin de valider de nouveaux variants pathogènes dans des gènes spécifiquement exprimés dans l'EPR, tels que ceux responsables de forme de rétinite pigmentaire (RP) dues aux variants MFRP [14] et MERTK [15]. Des défauts de formation du cil primaire ont également pu être identifiés dans des iEPR dérivés de cellules de patients atteints de RP liées à des variants génétiques dans les gènes RPGR [16], CEP290 [17] et PRPF31 [18 , 19]. La RP autosomique dominante due aux variants PRPF31 a bénéficié de plusieurs études approfondies qui ont démontré que l'iEPR de patients n'avait pas de polarité apicobasale et, par conséquent, avait une capacité de phagocytose diminuée (avec des agrégats qui s'accumulaient dans le cytoplasme [18 , 19]). Les agrégats ont pu être spécifiquement réduits par traitement avec des activateurs d'autophagie [20] et le phénotype général restauré par thérapie génique en apportant une copie normale du gène PRPF31 [21], ouvrant la voie à de nouvelles approches thérapeutiques.

Des études récentes ont confirmé la puissance des modèles iEPR. Une première étude a permis d'identifier le gène TBC1D32 comme important pour la ciliogenèse de l'EPR, car l'iEPR issu d'iPSC de patient atteint de RP liée à la présence de variants TBC1D32 présentait un cil primaire allongé, entraînant une transition épithélio-mésenchymateuse des cellules menant à une perte de fonctionnalité, tels un ralentissement du cycle visuel et une sécrétion de VEGF et PEDF perturbée [22]. Une seconde étude a démontré que l'iEPR de patients atteints de rétinite ponctuée albescente, due aux variants RLBP1 , présente une accumulation de gouttelettes lipidiques contenant des rétinoïdes [23]. Cette accumulation peut être diminuée par une approche de thérapie génique à l'aide d'un vecteur AAV5 portant le gène RLBP1 .

Le modèle iEPR a ainsi permis de modéliser plusieurs DRH et de tester l'efficacité de divers agents thérapeutiques dans un contexte humain, évitant ainsi des incohérences entre espèces. Cette approche unique dans un contexte humain est inestimable pour l'évaluation de l'efficacité de nouvelles thérapies et de leur translation vers la clinique.

Sur la base de l'identification des signaux moléculaires spécifiques requis pour la différenciation rétinienne, plusieurs laboratoires ont développé des protocoles à partir de CSE ou d'iPSC humaines en culture adhérente (2D) pour la génération de cellules rétiniennes et, plus particulièrement, de cellules présentant des caractéristiques de photorécepteurs [24-25-26]. Cependant, ces systèmes de cultures adhérentes ne reproduisent pas entièrement les aspects présents in vivo, notamment l'architecture cellulaire et les interactions entre les cellules. Au début des années 2010, des études pionnières ouvraient de fascinantes perspectives dans ce domaine via la génération de structures rétiniennes tridimensionnelles, récapitulant partiellement ou totalement le développement de la rétine in vitro [27].

Ces structures 3D complexes sont formées grâce à l'agrégation et l'auto-organisation des différents types de cellules d'une manière qui récapitule l'organisation cellulaire spatiale et la fonctionnalité de la rétine (fig. 31-3). Ainsi, ces organoïdes rétiniens présentent des photorécepteurs situés à leur surface et à l'opposé des cellules ganglionnaires situées en profondeur de la structure. Si la présence des cellules ganglionnaires n'est que transitoire en l'absence de cibles corticales, certains degrés de maturation des photorécepteurs, comme la réponse à la lumière, sont observés après une longue durée de culture (> 7–8 mois) de façon similaire à la chronologie du développement humain. Ces organoïdes rétiniens en 3D contiennent tous les principaux types de cellules rétiniennes, mais sont dépourvus de cellules microgliales et de vaisseaux sanguins. La monocouche d'EPR alignée sur les photorécepteurs est également absente. Néanmoins, ces modèles organoïdes dérivés d'iPSC de patients offrent l'avantage de partager le même patrimoine génétique que le patient et, ainsi, de permettre une étude dans un contexte génétique précis avec la possibilité d'observer un phénotype similaire à celui des patients porteurs de mutations (fig. 31-4).

Diverses approches peuvent être utilisées pour évaluer la pertinence des modèles d'organoïdes rétiniens et l'efficacité des interventions thérapeutiques potentielles. L'analyse des organoïdes rétiniens repose principalement sur des critères morphologiques. L'immunohistochimie est fréquemment employée pour examiner la perte ou la mauvaise localisation de protéines spécifiques, des marqueurs dont l'expression est étroitement liée à la viabilité et à la fonctionnalité des cellules rétiniennes. Dans les modèles pathologiques, ces marqueurs peuvent être mal localisés, réduits, voire totalement absents, témoignant d'une perturbation de la fonction cellulaire normale. Une des caractéristiques clés de la dégénérescence rétinienne est l'amincissement progressif des couches rétiniennes, souvent causé par la mort de populations cellulaires spécifiques. Étant donné que les organoïdes rétiniens présentent une stratification avec des couches nucléaires externes et internes bien définies, surveiller l'évolution de l'épaisseur de ces couches constitue une méthode précieuse pour évaluer la dégénérescence.

Par ailleurs, l'analyse transcriptomique des organoïdes permet de détecter les variations dans l'expression des gènes, offrant des indices sur les changements des fonctions rétiniennes. La technologie récente de séquençage de l'ARN à l'échelle d'une seule cellule ( single cell RNA-sequencing ) apporte une résolution encore plus fine, pouvant mettre en lumière les mécanismes cellulaires spécifiques.

Cependant, l'utilisation des organoïdes rétiniens reste encore limitée en termes d'essais fonctionnels. La phototransduction, fonction essentielle de la rétine, repose sur la détection de la lumière et sa conversion en signal électrique. Bien que des techniques d'électrophysiologie comme le patch clamp ou le réseau de microélectrodes ( multielectrode array ) aient permis de détecter une réponse à la lumière dans les organoïdes, celle-ci reste très limitée. Pour ces raisons, les analyses à l'aide d'organoïdes rétiniens se concentrent principalement sur des approches morphologiques, transcriptomiques et l'expression des protéines, avec un recours très restreint à des tests fonctionnels.

En dépit de leurs limites fonctionnelles, les organoïdes rétiniens sont devenus un modèle précieux pour l'étude des DRH (rétinopathie pigmentaire [RP], amaurose congénitale de Leber [ACL], etc.). De nombreuses études utilisant des iPSC dérivées de patients ont démontré que ces modèles peuvent récapituler fidèlement les phénotypes structurels et moléculaires observés chez les patients, offrant ainsi une ressource unique pour explorer les mécanismes pathologiques dans un contexte humain fidèle. Les organoïdes rétiniens se révèlent particulièrement adaptés pour l'étude des ciliopathies, comme celles causées par des variants dans le gène CEP290 , où des anomalies des cils des photorécepteurs sont observées [28]. Dans ces modèles, les défauts de formation des segments externes des photorécepteurs perturbent la cascade de phototransduction, en raison d'un mauvais transport de protéines comme la rhodopsine. De même, dans les RP impliquant des variants du gène PRPF31 , codant pour un facteur d'épissage, les organoïdes rétiniens dérivés d'iPSC de patients présentent des anomalies de localisation des protéines essentielles et une dégénérescence progressive des photorécepteurs [18 , 19] ainsi que des cellules de l'EPR. Ce défaut d'épissage des pré-ARNm entraîne non seulement une perturbation de la structure rétinienne, mais également une altération de la fonctionnalité des photorécepteurs.

Par ailleurs, les organoïdes ont montré leur pertinence pour modéliser les dysfonctionnements du cycle visuel, comme ceux causés par des variants génétiques du gène ABCA4 . Ces variants altèrent le transport des rétinoïdes, essentiel au recyclage des photopigments, et provoquent une accumulation de sous-produits toxiques, un phénomène clé dans le développement de la maladie de Stargardt, liée à des variants génétiques du gène ABCA4 [29]. Dans le cas de dystrophies liées à des variants dans des gènes codant pour des protéines de la phototransduction (phosphodiestérase, rhodopsine), les organoïdes rétiniens dérivés d'iPSC de patients présentent une dégénérescence accélérée des photorécepteurs, caractéristique de formes sévères de RP [30].

Ces avancées soulignent que l'utilisation des organoïdes rétiniens offre une plateforme unique pour explorer les mécanismes pathologiques à l'origine des DRH et tester des approches thérapeutiques prometteuses, telles que les thérapies géniques ciblant les anomalies moléculaires identifiées.

Le développement de ces nouvelles thérapies géniques exige des tests rigoureux et des preuves de concept, généralement réalisés à l'aide de modèles animaux. Cependant, lorsque aucun modèle animal ne reproduit fidèlement la pathologie humaine, les organoïdes rétiniens se révèlent être une alternative prometteuse pour l'évaluation des thérapies géniques potentielles. Plusieurs études récentes ont démontré leur pertinence dans la validation des approches fondées sur la supplémentation génique via des vecteurs viraux de type AAV. Ces travaux ont montré une restauration efficace de l'expression du gène cible dans les types cellulaires affectés, notamment les photorécepteurs, ainsi qu'une réduction significative, voire une réversion complète, des phénotypes associés à la pathologie, tels que la dégénérescence des photorécepteurs, observés dans des organoïdes dérivées d'iPSC de patients atteints de RP ou d'ACL liées à des variants sur différents gènes, comme AIPL, CRB1, NPHP5, RPGR, RP2, PRPF31 [16 , 19 , 30-31-32-33].

Ces résultats soulignent le potentiel des organoïdes rétiniens comme outil précieux pour accélérer le développement de thérapies géniques adaptées aux maladies rétiniennes humaines.