Après près de 30 ans de promesses tempérées par des revers, les thérapies géniques deviennent rapidement une composante essentielle de l'arsenal thérapeutique pour une variété de maladies humaines héréditaires et acquises [ 1]. Le concept de thérapie génique, décrit pour la première fois de manière prophétique par Theodore Friedmann en 1972, a évolué d'une possibilité théorique à une réalité clinique, apportant de nouvelles options de traitement dans de multiples domaines de la médecine [2].
La thérapie génique était initialement envisagée comme un traitement uniquement pour les troubles héréditaires, fondée sur le principe qu'un seul traitement pourrait obtenir un bénéfice clinique durable, potentiellement curatif. Les chercheurs ont émis l'hypothèse que, contrairement aux médicaments à base de protéines qui peuvent nécessiter des perfusions répétées, les thérapies géniques délivrées à des cellules à longue durée de vie pourraient permettre une production soutenue de protéines endogènes, comme les facteurs de coagulation dans l'hémophilie. Cette approche était également prometteuse pour les atteintes nécessitant un remplacement cellulaire à long terme, comme celles traitables par des cellules souches hématopoïétiques (CSH) génétiquement modifiées. Plus généralement, le terme « thérapie génique» englobe désormais largement l'introduction ou la manipulation de séquences d'ADN ou d'ARN dans les cellules humaines pour traiter des maladies. Il existe un consensus général entre la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis, l'Agence européenne des médicaments (European Medicines Agency [EMA]) et l'American Society of Gene and Cell Therapy (ASGCT) pour définir la thérapie génique comme des changements dans l'expression des gènes, obtenus en remplaçant ou en corrigeant un gène responsable d'une maladie, en inactivant un gène cible, ou en insérant un gène nouveau ou modifié, en utilisant un vecteur ou un système de délivrance de séquence génétique ou de gène, des micro-organismes génétiquement modifiés, des virus ou des cellules.
Le voyage de la thérapie génique du concept à la clinique a commencé sérieusement au début des années 1990, mais a été marqué par des cycles répétés d'optimisme suivis de résultats d'essais cliniques décevants [3]. De nombreuses thérapies expérimentales précoces se sont révélées n'apporter aucun bénéfice clinique ou produire des toxicités inattendues qui, dans certains cas, ont conduit à des décès de patients largement médiatisés. Ces revers ont conduit à une réévaluation du domaine, avec un recentrage sur la compréhension de la science fondamentale sous-jacente aux approches de thérapie génique.
La fin des années 1990 et le début des années 2000 ont vu le développement de nouveaux vecteurs et une meilleure compréhension des cellules cibles, déclenchant une deuxième génération d'essais cliniques. Ces essais ont produit des preuves de modification génétique soutenue des tissus cibles et, dans certains cas, des preuves de bénéfice clinique. Cependant, les progrès ont été ralentis par l'émergence de toxicités graves liées à une efficacité élevée de transfert de gènes, notamment la génotoxicité insertionnelle, la destruction immunitaire des cellules génétiquement modifiées et les réactions immunitaires liées à l'administration de vecteurs [4].
Au cours de la dernière décennie, la maturation continue de la « science» de la thérapie génique, les modifications de sécurité ainsi que les améliorations de l'efficacité et de la délivrance du transfert de gènes ont finalement abouti à des progrès cliniques substantiels [5]. Plusieurs thérapies géniques et cellulaires génétiquement modifiées sont désormais des médicaments approuvés, et plus d'une douzaine d'autres ont obtenu la désignation de « thérapie de pointe» par les régulateurs du monde entier [1].
La portée de la thérapie génique s'est également étendue au-delà des troubles héréditaires pour inclure des atteintes acquises, un concept illustré au mieux par l'ingénierie génétique des cellules T pour l'immunothérapie du cancer. Des études cliniques récentes ont montré que des perfusions uniques de cellules T modifiées avec des gènes synthétiques codant pour un récepteur antigénique chimérique peuvent produire des réponses durables chez un sous-ensemble de patients atteints de certains types de cancer.
La thérapie génique de l'œil
L'œil est apparu comme un précurseur dans le domaine de la thérapie génique, possédant des attributs uniques qui en font une cible idéale pour les interventions génétiques. Son accessibilité physique et visuelle, couplée à son privilège immunitaire relatif, l'ont favorisé comme site idéal pour l'administration de thérapie génique [ 6].
Plusieurs facteurs contribuent à l'adéquation de l'œil pour la thérapie génique :
la nature transparente de l'œil permet une visualisation directe des structures oculaires, facilitant la délivrance précise et le suivi des agents thérapeutiques;
la barrière hématorétinienne et d'autres mécanismes immunosuppresseurs créent un environnement relativement immunoprivilégié, réduisant le risque de réponses immunitaires indésirables aux vecteurs de thérapie génique;
le volume limité de l'œil nécessite de plus petites quantités d'agents thérapeutiques, réduisant potentiellement les effets secondaires systémiques et les coûts de fabrication;
la structure segmentée de l'œil permet une délivrance ciblée à des tissus ou types cellulaires spécifiques, améliorant la spécificité du traitement;
la présence de deux yeux permet l'utilisation de l'œil non traité comme contrôle interne dans les essais cliniques, fournissant des données comparatives précieuses.
Conventionnellement, la thérapie génique oculaire implique la supplémentation de gènes porteurs de variants perte de fonction à l'aide d'un vecteur viral. De nombreux essais cliniques en cours sur diverses maladies rétiniennes héréditaires (MRH) utilisent cette méthode, la première et seule thérapie génique oculaire actuellement approuvée, le Luxturna®, ciblant la rétinopathie associée à RPE65 avec cette approche.
Les virus adéno-associés ( adeno-associated virus [AAV]) sont devenus les vecteurs de choix pour la thérapie génique oculaire, montrant un bon tropisme pour l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR), les photorécepteurs et les cellules ganglionnaires de la rétine [7]. Le succès relatif des études Luxturna® pour le traitement de l'amaurose congénitale de Leber (ACL) a ouvert la voie à des essais cliniques ciblant d'autres maladies rétiniennes telles que la rétinite pigmentaire (RP), la neuropathie optique héréditaire de Leber (NOHL), la choroïdérémie et l'achromatopsie.
Des exemples de succès dans le domaine incluent des essais cliniques arrivés jusqu'en phase II/III comme :
LUMEVOQ (GS010) de GenSight Biologics pour la neuropathie optique de Leber avec variant pathogène sur le gène ND4 ;
XIRIUS de Nightstar/Biogen pour la rétinite pigmentaire liée à l'X ( x-linked retinitis pigmentosa [XLRP]);
4D-125 et 4D-150 de 4D Molecular Therapeutics pour XLRP et DMLAn;
botaretigene sparoparvovec (AAV-RPGR) Janssen/MeiraGTx pour XLRP;
OCU400 par Ocugen pour indication de rétinite pigmentaire (RP);
cotoretigene toliparvovec (BIIB112) par Biogen pour XLRP;
laruparetigene zosaparvovec (AGTC-501) par Beacon Therapeutics pour XLRP;
ABBV-RGX-314 par Regenxbio/AbbVie pour la DMLAn.
Afin d'élargir le spectre de maladies génétiques traitables avec la thérapie génique, la recherche s'est tournée vers les technologies de l'édition du génome. L'édition génique est une technique moléculaire permettant de modifier directement l'ADN au sein des cellules, comparable à des « ciseaux moléculaires» capables de couper le matériel génétique à un endroit précis [8]. Le système CRISPR-Cas9, découvert initialement comme mécanisme de défense bactérien, utilise une enzyme Cas9 guidée par un ARN pour reconnaître et couper une séquence d'ADN spécifique, permettant ensuite soit de désactiver un gène, soit d'insérer une nouvelle séquence. Ces technologies ont ouvert de nouvelles voies pour le traitement des maladies rétiniennes. Par exemple, EDIT-101, une thérapie fondée sur CRISPR ciblant le variant intronique profond c.2991+1655A>G sur CEP290 , a montré des résultats prometteurs dans les premiers essais cliniques pour l'ACL10 [9]. Cette approche est particulièrement précieuse pour traiter les variants génétiques dans les grands gènes qui dépassent la capacité de chargement des vecteurs AAV traditionnels.
Considérations de sécurité et orientations futures
Bien que les progrès de la thérapie génique oculaire aient été remarquables, plusieurs défis et considérations de sécurité restent au premier plan de la recherche et de l'application clinique.
Sécurité de la thérapie génique par AAV
L'AAV de type sauvage s'intègre dans le génome, mais les vecteurs AAV recombinants utilisés pour la thérapie génique semblent rester majoritairement épisomiques, réduisant significativement le risque de mutagenèse insertionnelle. Bien que certains événements d'insertion aient été enregistrés dans des études sur les souris entraînant des carcinomes hépatocellulaires après administration systémique, aucune génotoxicité n'a été observée dans les études sur les grands animaux ou les essais cliniques humains impliquant la thérapie AAV. L'administration localisée d'AAV pour la thérapie génique oculaire renforce davantage leur profil de sécurité dans l'œil.
Les études actuelles montrent que la thérapie génique oculaire AAV est associée à une incidence cumulative de 8 % d'événements indésirables graves (EIG). La plupart des EIG étaient probablement causés par la procédure chirurgicale utilisée pour délivrer le vecteur thérapeutique, en particulier chez les patients atteints de maladie avancée et de rétines fragiles. Les complications courantes comprennent l'amincissement maculaire, l'hémorragie sous-conjonctivale, la douleur et l'irritation oculaires, les changements de pression intraoculaire et la formation de cataracte. Beaucoup de ces complications étaient traitables et transitoires.
Des événements inflammatoires liés à la thérapie ont été observés, en particulier avec des doses virales plus élevées. Cependant, la plupart des événements inflammatoires étaient temporaires et se sont résolus avec le temps ou un traitement supplémentaire. Une dose de 1 à 1,5 × 10 11 génomes viraux/œil est généralement considérée comme à la fois efficace et sûre, associée à une inflammation minimale.
Pour améliorer les profils de sécurité, les doses plus élevées devraient être évitées pour prévenir l'inflammation oculaire. Les injections sous-rétiniennes devraient éviter la fovéa pour prévenir l'amincissement maculaire iatrogène, sauf dans les cas d'acuité visuelle très réduite ou d'atrophie fovéale préexistante. L'OCT peropératoire peut aider à guider l'injection et à éviter d'endommager les rétines délicates chez les patients atteints de maladie avancée.
Efficacité et longévité
L'efficacité de la thérapie génique oculaire varie selon les différentes maladies et les patients individuels. Les facteurs influençant les résultats thérapeutiques comprennent le stade de progression de la maladie, l'état physique de la rétine au moment du traitement et le variant génétique spécifique ciblé. La longévité des effets thérapeutiques reste une question cruciale, certaines études montrant des bénéfices soutenus sur plusieurs années, tandis que d'autres indiquent un déclin progressif de l'efficacité au fil du temps.
Orientations futures
À mesure que le domaine de la thérapie génique rétinienne évolue, plusieurs approches innovantes sont explorées pour répondre aux limitations actuelles et élargir les options de traitement :
conception avancée de vecteurs : des systèmes AAV doubles sont en cours de développement pour surmonter les limitations de taille, permettant la livraison de grands gènes en deux parties. Des vecteurs avec des propriétés de diffusion augmentée sont également en cours de développement afin d'éviter les effets indésirables liés aux décollements. Des vecteurs non viraux, tels que des systèmes de transfert à base de nanoparticules, sont aussi à l'étude;
systèmes d'activation/inhibition édition par dérivés de CRISPR : en plus des outils d'édition du génome qui permettent de corriger l'ADN, des technologies d'activation ou d'inhibition par CRISPR sont aussi en cours de développement. Ce type de technologie offre des avantages par rapport au remplacement de gènes traditionnel, y compris la capacité d'activer des allèles normaux dans les conditions d'haplo-insuffisance, de surréguler des gènes fonctionnellement équivalents dans les atteintes récessives, et de contrôler précisément l'expression génique pour les maladies complexes;
thérapies fondées sur l'ARN : des approches d'oligonucléotides antisens et d'édition de l'ARN sont en cours de développement pour moduler l'expression génique ou corriger les variants au niveau de l'ARN, offrant des solutions potentielles pour variants génétiques à effet dominant négatif;
approches régénératives : la combinaison de la thérapie génique avec des stratégies de remplacement cellulaire, telles que la reprogrammation des cellules gliales de Müller ou la transplantation de cellules rétiniennes dérivées de cellules souches génétiquement modifiées, est prometteuse pour le traitement de la dégénérescence rétinienne avancée.
Conclusion
La thérapie génique rétinienne se trouve à l'avant-garde d'une révolution thérapeutique en ophtalmologie. En exploitant le pouvoir de la manipulation génétique pour s'attaquer aux causes profondes des maladies rétiniennes, nous ouvrons de nouvelles perspectives d'espoir pour les patients qui faisaient autrefois face à une perte de vision inévitable. Alors que nous continuons à affiner ces approches, à élargir leurs applications et à répondre aux préoccupations de sécurité, l'avenir des soins rétiniens semble plus brillant que jamais, promettant de préserver et de restaurer la vision pour les générations à venir.
II. Thérapie génique par remplacement de gène : leçons tirées du développement du premier médicament de thérapie génique approuvé par la fda, le voretigène néparvovec-rzyl 1
J. Bennett, A.M. Maguire
Introduction
Le premier agent de thérapie génique administré directement in vivo pour traiter une maladie génétique a été approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) aux États-Unis en 2017. Il s'agissait d'un virus adéno-associé ( adeno-associated virus [AAV]) recombinant transportant l'ADNc de type sauvage codant pour la protéine de 65 kDa de l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR), RPE65.
Cet agent, le voretigène néparvovec-rzyl (Luxturna®), connu sous le nom d'AAV2-hRPE65v2 durant son développement et les essais cliniques, a été approuvé par l'European Medicines Agency (EMA) l'année suivante, puis dans de nombreux autres pays sur plusieurs continents.
Le produit est un vecteur adéno-associé de sérotype 2 (AAV2) qui délivre l'ADNc humain RPE65 à la rétine de patients atteints de dégénérescence rétinienne héréditaire (amaurose congénitale de Leber de type 2 [ACL2]) due à des variants bialléliques de RPE65 .
Ce médicament est administré dans des centres d'excellence des différents pays, par des chirurgiens formés à réaliser la procédure d'injection sous-rétinienne nécessaire à l'administration de l'agent. Cette procédure place le vecteur AAV en contact direct avec les cellules malades de l'EPR. Avant cette période, les injections sous-rétiniennes n'étaient utilisées que rarement en pratique clinique, principalement pour traiter la néovascularisation choroïdienne et ses complications, par exemple une hémorragie sous-rétinienne aiguë maculaire.
Les enseignements tirés du développement de Luxturna® et la réduction du risque lié à l'administration de vecteurs AAV dans l'espace sous-rétinien (jusqu'à environ 1,5 × 10 11 génomes viraux [vg]) ont ensuite été appliqués pour mener des études précliniques et cliniques visant à développer des traitements géniques pour des dizaines d'autres maladies rétiniennes héréditaires ou acquises responsables de cécité. Les résultats positifs ont stimulé des travaux dans de petites entreprises de biotechnologie ainsi que dans de grands groupes pharmaceutiques.
Ces succès ont également encouragé des patients atteints d'autres maladies rétiniennes orphelines à s'unir et à plaider pour le développement d'un traitement ciblant leur propre « gène». Il existe désormais plus d'une douzaine d'essais de thérapie génique par augmentation génétique, à divers stades d'avancement, qui ont adapté une approche similaire à celle utilisée pour RPE65 afin de traiter d'autres formes de dégénérescence rétinienne.
La stratégie utilisée pour développer la thérapie génique RPE65 sert aussi à tester d'autres approches de thérapie génique pour des maladies rétiniennes humaines, incluant :
la délivrance de récepteurs leurres;
des outils d'édition génique;
des ARN antisens;
des gènes mitochondriaux;
et même des gènes destinés à rendre d'autres cellules rétiniennes sensibles à la lumière (thérapie optogénétique).
L'expérience acquise avec RPE65 a également été mise à profit pour développer des thérapies géniques pour d'autres maladies neurologiques. Le deuxième produit de thérapie génique approuvé par la FDA pour une maladie génétique (l'atrophie musculaire spinale) a été Zolgensma® (onasemnogène abéparvovec, approuvé en 2020).
Des essais cliniques de thérapie génique sont en cours pour diverses autres maladies héréditaires du système nerveux central, notamment plusieurs formes de mucopolysaccharidoses, ainsi que des maladies telles que Canavan et Batten. Plusieurs de ces maladies présentent des manifestations rétiniennes, ce qui laisse envisager une utilisation potentielle de thérapies géniques administrées par voie intraoculaire. Des études de thérapie génique sont également prévues pour l'administration dans la cochlée, afin d'évaluer des traitements pour des formes génétiques de surdité.
Dans ce chapitre, nous examinons certaines préoccupations et certains défis rencontrés lors du développement de la thérapie génique RPE65, et comment les leçons apprises pourraient influencer la mise au point d'autres thérapies géniques. Nous discutons également des questions encore en suspens et de la manière dont les expériences issues d'études antérieures pourraient orienter le développement de nouveaux traitements pour ces maladies autrefois incurables et responsables de cécité.
Voie d'administration
Lorsque nous avons commencé les études précliniques sur RPE65 en utilisant le modèle naturel du chien Briard, nous avons montré que l'administration sous-rétinienne d'AAV2.RPE65 entraînait une récupération de la fonction rétinienne et visuelle. En revanche, l'administration intravitréenne d'une dose similaire ne produisait aucun effet [10].
Des études ultérieures menées chez des souris et des chiens atteints, ainsi que chez des singes non affectés ont confirmé que l'administration dans l'espace sous-rétinien était nécessaire pour la transduction des cellules de la rétine externe et donc pour l'efficacité du traitement (chez les chiens atteints). L'injection intravitréenne d'AAV2 entraînait une transduction des cellules ganglionnaires, mais pas des cellules de la rétine externe, ce qui aboutissait à une absence d'efficacité dans cette maladie [11-12-13].
Après une injection intravitréenne, l'expression était observée non seulement dans les cellules ganglionnaires de la rétine, mais également le long des axones constituant le nerf optique, le chiasma optique et jusqu'à la première synapse dans le corps géniculé latéral. La transduction de la voie visuelle après injection intravitréenne d'AAV2 n'était pas une surprise, car nous avions déjà observé ce phénomène [14-15-16].
Lors de la planification des études précliniques formelles de sécurité et de toxicité pour RPE65 , nous avons émis l'hypothèse que l'un des risques potentiels de la thérapie génique RPE65 serait l'échec de l'injection sous-rétinienne, entraînant une administration accidentelle du vecteur AAV2.hRPE65v2 dans le vitré. Nous avons aussi supposé qu'une complication chirurgicale, telle qu'une fuite du vecteur depuis le site de rétinotomie, pourrait exposer la cavité vitréenne.
Bien que la chirurgie sous-rétinienne prévue chez l'humain inclue une vitrectomie et un échange air-liquide, réduisant ainsi l'exposition des cellules bordant la cavité vitréenne, une fuite pourrait entraîner une inflammation ou une transduction non souhaitée des cellules ganglionnaires ou des structures du segment antérieur.
Ainsi, nous avons inclus des injections intravitréennes à fortes doses, en plus des injections sous-rétiniennes, dans nos études de bonnes pratiques de laboratoire (BPL) de toxicité, même si la voie d'administration prévue chez l'humain était exclusivement sous-rétinienne. Cette stratégie, intégrant un « scénario du pire», est une approche que nous et d'autres continuons d'utiliser pour l'évaluation des risques liés à des vecteurs de thérapie génique pour d'autres dégénérescences rétiniennes héréditaires.
Nous avons également observé que certains vecteurs viraux recombinants administrés par voie intravitréenne à forte dose peuvent provoquer une inflammation, tandis que les mêmes doses injectées en sous-rétinien sont bien tolérées [ 17].
La mise au point de vecteurs AAV capables de traverser la rétine et de cibler les cellules de la rétine externe après injection intravitréenne (sans provoquer d'inflammation), ou la délivrance de vecteurs spécifiques dans l'espace suprachoroïdien pour transduire les cellules de la rétine externe nécessiteront des études supplémentaires afin d'évaluer l'effet du site d'administration.
Les extrapolations de doses pour les maladies rétiniennes, des modèles animaux vers l'être humain, ne sont pas simples
Les yeux des animaux de différentes espèces diffèrent considérablement sur le plan anatomique, ce qui implique de nombreuses considérations lorsqu'il s'agit d'extrapoler des doses d'une espèce à une autre (fig. 45-1
Fig. 45-1Anatomie comparative.Différences approximatives de taille de l'œil et du cristallin chez les espèces couramment utilisées pour les tests précliniques, comparées à l'œil humain. La taille de l'œil et la place relative occupée par le cristallin sont des facteurs qui déterminent la voie d'administration ainsi que le volume (et donc la dose virale) pouvant être administré.
Source : Bennet J, Maguire AM. Lessons learned from the development of the first FDA-approved gene therapy drug, voretigene neparvovec-rzyl. Cold Spring Harb Perspect Med 2023; 13 : a04130. Figure élaborée à partir de données issues de Faqui [58] et Dejneka et al. [59], ainsi que de mesures réalisées dans le laboratoire Bennett.
). Par exemple, le cristallin des rongeurs occupe la majeure partie de la cavité vitréenne, contrairement à celui des chiens et des primates; les yeux de certaines espèces sont plus sphériques que d'autres; le poids de l'œil et le volume du vitré varient selon l'espèce; l'irrigation sanguine oculaire diffère également d'une espèce à l'autre, et l'approche chirurgicale varie elle aussi en raison de ces différences anatomiques. Un point particulièrement important est que les animaux non primates ne possèdent pas de véritable macula.
On peut approximativement comparer les différences de taille entre les yeux des différentes espèces comme guide pour les études comparatives, mais cela ne tient pas compte des aspects anatomiques mentionnés ci-dessus, ni des différences de composition des photorécepteurs entre espèces (par exemple présence d'une macula uniquement chez les primates; prédominance des bâtonnets sur les cônes dans la rétine de souris, selon un ratio 10:1; ou encore la présence, chez le chien, d'une zone focale à densité accrue de cônes, l'area centralis).
De plus, dans certains modèles animaux, le traitement n'est réellement thérapeutique que s'il est administré très tôt dans le développement. Pour le traitement de la forme ACL5, par exemple, l'efficacité est observée lorsque la souris est traitée au 4ᵉ jour postnatal, alors que l'œil ne représente qu'une fraction de la taille d'un œil de souris adulte (voir fig. 45-1
Fig. 45-1Anatomie comparative.Différences approximatives de taille de l'œil et du cristallin chez les espèces couramment utilisées pour les tests précliniques, comparées à l'œil humain. La taille de l'œil et la place relative occupée par le cristallin sont des facteurs qui déterminent la voie d'administration ainsi que le volume (et donc la dose virale) pouvant être administré.
Source : Bennet J, Maguire AM. Lessons learned from the development of the first FDA-approved gene therapy drug, voretigene neparvovec-rzyl. Cold Spring Harb Perspect Med 2023; 13 : a04130. Figure élaborée à partir de données issues de Faqui [58] et Dejneka et al. [59], ainsi que de mesures réalisées dans le laboratoire Bennett.
À ce stade chez la souris, où l'on trouve encore des progéniteurs rétiniens mais pas de photorécepteurs différenciés, le développement est approximativement équivalent au premier trimestre de grossesse chez l'être humain.
Un point commun aux rétines de chaque espèce est qu'après une injection sous-rétinienne, l'aire de rétine exposée à une quantité déterminée du produit testé (AAV, dans ce cas) peut être estimée à partir du volume injecté. En augmentant le volume de solution, on augmente la surface de rétine – et donc le nombre de cellules – exposée au vecteur.
Comme le nombre de cellules de l'EPR ou de photorécepteurs dans diverses espèces humaines et animales est connu ou peut être estimé, et que la dose totale administrée est également connue, il est possible d'estimer le nombre de particules virales par cellule exposée, c'est-à-dire une approximation de la multiplicité d'infection ( multiplicity of infection [MOI]).
Bien que les autorités réglementaires préfèrent aujourd'hui examiner les données en termes de dose totale administrée, les estimations de MOI pourraient être plus pertinentes pour le traitement des maladies rétiniennes que les mesures de dose totale. Nous avons effectué des calculs sur les effets potentiels du MOI sur la sécurité et l'efficacité, ce qui a renforcé notre confiance dans les choix de dose finaux utilisés dans nos essais cliniques de phases I à III pour le déficit en RPE65 .
Ces données pourraient aider à orienter la sélection des doses dans les futurs essais cliniques. Un exemple d'exercice de calcul de dose pour un essai hypothétique de thérapie génique dans une maladie rétinienne dégénérative est montré à la figure 45-2
Fig. 45-2Exercice d'extrapolation de dose.Données hypothétiques utilisant l'efficacité d'un modèle murin atteint et la toxicité d'un modèle de grand animal non atteint (porc) pour sélectionner les doses à utiliser dans un essai clinique de phase I chez l'humain. L'efficacité chez la souris (carrés bleus) nécessite une administration sous-rétinienne de la dose n° 3 (flèche). (La dose approximative [vg] par cellule est calculée en fonction du nombre connu de cellules dans les rétines des différentes espèces et de la surface rétinienne ciblée. La surface ciblée dépend du volume injecté.) En parallèle, chez le porc (carrés verts), aucune toxicité n'est observée (niveau sans effet adverse observable) aux doses n° 1 et n° 2 (têtes de flèche). Des signes de toxicité apparaissent à la dose n° 3. Les doses proposées pour l'humain (polygones rouges) couvriraient une plage où l'efficacité est démontrée chez la souris et la sécurité chez le porc. Typiquement, une étude de sécurité de thérapie génique de phase I utilise trois doses. L'objectif est d'éviter les doses offrant une faible probabilité d'efficacité ou un risque élevé de toxicité.
Source : Bennet J, Maguire AM. Lessons learned from the development of the first FDA-approved gene therapy drug, voretigene neparvovec-rzyl. Cold Spring Harb Perspect Med 2023; 13 : a04130.
.
En raison de la structure épithéliale de la rétine et de son rapport surface/volume élevé, la pharmacodynamie peut différer considérablement de celle d'autres organes tels que le foie ou le muscle.
Caractéristiques d'adhérence et de sécurité du dispositif d'administration vis-à-vis des vecteurs AAV
Conformément aux exigences de la FDA, nous avons mené des études sur la compatibilité des dispositifs d'injection sous-rétiniens que nous prévoyions d'utiliser dans nos essais cliniques avec le réactif de test AAV2.hRPE65v2. Aucune préoccupation en matière de sécurité n'a été détectée concernant les modifications de pH, les particules ou les niveaux d'endotoxines après incubation et administration de notre AAV par le biais de ces dispositifs d'injection en laboratoire. Cependant, nous avons été surpris par l'ampleur de la perte de vecteur due à l'adhésion aux surfaces dites « inertes» du dispositif d'injection et/ou des tubulures. Jusqu'à 80 % du vecteur était perdu en raison de sa fixation aux surfaces internes du dispositif (fig. 45-3
Fig. 45-3Dosage précis du virus adéno-associé (AAV), dispositifs et tensioactif. Lorsqu'un AAV est chargé dans un dispositif d'injection, jusqu'à 80 % des particules se fixent aux surfaces dites « inertes» du dispositif, rendant le dosage précis difficile. Bennicelli et al. [3] ont montré que l'ajout d'une petite quantité de tensioactif (Pluronic F68®) empêche cette fixation et permet un dosage précis. (X) Seringue sans tensioactif.
Source : Bennet J, Maguire AM. Lessons learned from the development of the first FDA-approved gene therapy drug, voretigene neparvovec-rzyl. Cold Spring Harb Perspect Med 2023; 13 : a04130.
). Cela nous a poussés à tester, puis à incorporer un tensioactif non ionique, le Pluronic F68® (PF68; poloxamère 188), dans notre produit AAV. En présence de 0,001 % de PF68®, la dose complète de vecteur est délivrée par le dispositif. L'inclusion de PF68® à cette concentration n'a pas entraîné de toxicité. Cette addition importante a depuis été intégrée dans la délivrance de l'AAV lors de nombreux autres essais cliniques (par exemple [19 , 20]).
Importance de l'évaluation de la proportion de capsides d'AAV « pleines» par rapport aux capsides « vides» dans les études cliniques
Le protocole utilisé par notre équipe de production pour générer à la fois des AAV de qualité recherche et de qualité clinique incluait une ultracentrifugation sur gradient de chlorure de césium (CsCl) afin de séparer les capsides d'AAV plus lourdes, contenant la cassette du transgène (« pleines»), de celles qui étaient vides. Cette étape est cruciale, car les capsides vides ne confèrent aucun effet thérapeutique potentiel. Il n'y a aucun avantage à exposer le receveur à des capsides d'AAV vides. En réalité, cela ne peut être qu'indésirable, voire nocif sur le plan immunologique [21]. Les capsides vides ont en effet le potentiel d'augmenter les réponses immunitaires innées ou adaptatives dirigées contre le vecteur. Dans des études systémiques, l'administration systémique de capsides vides a été associée à une élévation des transaminases hépatiques chez la souris [22]. Notre produit AAV2.hRPE65v2 contenait moins de 5 % de capsides vides.
Les protocoles de production des AAV ont évolué depuis la préparation de nos premiers lots d'AAV en conformité avec les bonnes pratiques de fabrication (BPF) en 2007, et de nombreux groupes de production ont remplacé la centrifugation sur gradient de CsCl par d'autres méthodes de purification. Nous soupçonnons cependant que certaines différences de résultats observées entre les différents essais cliniques pourraient être liées au rapport entre les capsides pleines et vides. Bien entendu, il existe d'autres contaminants potentiels des préparations d'AAV qui suscitent une préoccupation égale, voire supérieure, en matière de toxicité, notamment les fragments d'acides nucléiques résiduels issus du processus de production et partiellement co-purifiés avec les vecteurs [23].
En résumé, la préparation de capsides d'AAV « pleines» doit être aussi pure que possible, et les détails correspondants doivent être recueillis afin de pouvoir, à l'avenir, corréler les caractéristiques du vecteur avec la sécurité et l'efficacité. Il s'agit d'un critère important dans le choix d'une plateforme de production de vecteurs qui fournira le réactif pour les tests et les applications cliniques.
La force des collaborateurs, des patients et des réseaux sociaux
Lorsque nous avons obtenu les approbations réglementaires fédérales et institutionnelles nous permettant d'inclure notre premier sujet dans l'essai de thérapie génique RPE65 du Children's Hospital of Philadelphia (CHOP) au milieu de l'année 2007, nous avons été surpris de constater qu'il n'y avait aucun patient américain éligible à inviter. De nombreux patients diagnostiqués avec une ACL n'avaient pas été génotypés et ne répondaient donc pas au critère d'inclusion exigeant des variants bialléliques du gène RPE65 . D'autres n'étaient connus que de spécialistes particuliers qui préparaient ou menaient des investigations concurrentes. À cette époque, peu de laboratoires réalisaient des criblages génétiques sur des échantillons de patients, et encore moins étaient agréés pour délivrer des diagnostics génétiques conformes aux normes Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA). Il n'y avait aucune incitation à effectuer des tests CLIA, car les assurances ne couvraient pas les coûts (puisqu'il n'existait aucun traitement approuvé).
Le Dr Edwin Stone avait anticipé ce besoin et créé le John and Marcia Carver Nonprofit Genetic Testing Laboratory (Université de l'Iowa). Nous avons profité d'une collaboration de longue date avec des collègues de la Deuxième Université de Naples, en Italie, les Drs Simonelli, Auricchio, Banfi, Testa et Rossi. Le Dr Simonelli, spécialiste des dégénérescences rétiniennes avec une importante pratique de référence couvrant la majeure partie de l'Italie, menait déjà des études génotype-phénotype. Elle avait envoyé des échantillons de sang à son collègue en génétique moléculaire, le Dr Banfi (Telethon Institute of Genetics and Medicine [TIGEM]), qui avait identifié plus d'une demi-douzaine de personnes porteuses de variants bialléliques de RPE65 , considérées par le Dr Simonelli comme de bons candidats pour nos études. Comme les tests du Dr Banfi n'avaient pas été réalisés selon les normes CLIA, nous avons envoyé des échantillons sanguins supplémentaires au laboratoire Carver pour une vérification CLIA. Les tests ont confirmé qu'il s'agissait bien de la maladie RPE65 et fourni la documentation officielle nécessaire.
Le Dr Simonelli a informé ses patients RPE65 de notre étude et ceux-ci étaient impatients d'y participer. À cette époque, avant le début de tout essai de thérapie génique rétinienne chez l'humain aux États-Unis, de nombreuses inconnues subsistaient quant à la sécurité du réactif et aux complications potentielles. Comme les patients du Dr Simonelli vivaient en Italie, nous craignions qu'il soit risqué de les renvoyer après l'intervention sans accès à un suivi immédiat. Ces préoccupations ont été résolues lorsque le Dr Simonelli a proposé de devenir l'investigatrice principale d'un second site pour notre étude, à Naples. Elle et son équipe établiraient des visites de base et de suivi en double de celles prévues au CHOP. Une organisation de recherche sous contrat a confirmé que le Dr Simonelli disposait de l'équipement clinique nécessaire. Nous avons fourni l'équipement à utiliser pour les mesures exploratoires. L'administration chirurgicale du vecteur ne se ferait qu'au CHOP. Non seulement les sujets bénéficieraient de soins en Italie et aux États-Unis, mais de plus tous les tests cliniques seraient dupliqués, ce qui ajouterait de la validité et de la puissance statistique aux données. Cela a permis l'inclusion des quatre premiers sujets de notre essai clinique, tous italiens. Au moment où nous étions prêts à inclure des sujets supplémentaires dans notre étude de phase I, des spécialistes du Mexique, de Belgique et des États-Unis (dont les Drs Villanueva, LeRoy, Fulton et Traboulsi) avaient génotypé et orienté des patients.
Au moment où nous étions prêts à lancer nos études de phase III en 2013, les réseaux sociaux étaient devenus populaires et facilement accessibles. Les informations sur les résultats positifs de sécurité et d'efficacité issus de nos études de phase I et de suivi étaient disponibles, et les familles ont commencé à nous contacter directement. Les connexions et annonces étaient partagées via Facebook et d'autres réseaux sociaux. Des patients venus d'aussi loin que la Nouvelle-Zélande et l'Inde nous ont contactés directement, y compris une personne de l'ouest des États-Unis qui avait entendu parler de nos études en récupérant son chien guide. Nous avons même reçu de nombreuses demandes de propriétaires d'animaux souhaitant amener leurs chiens ou chats bien-aimés dans notre clinique pour recevoir une thérapie génique contre diverses maladies oculaires. Entre-temps, les patients et leurs familles ont créé leurs propres groupes de défense en ligne (spécifiques à certains gènes), organisé des collectes de fonds, des sessions d'éducation et des rencontres où les patients et leurs familles pouvaient rencontrer des scientifiques et des cliniciens, apprendre les derniers résultats et technologies, et même se faire génotyper.
De nombreuses histoires inspirantes y ont également été partagées, comme celle d'un patient atteint de variants RPE65 qui a brillé lors des compétitions America's Got Talent et American Idol ( https://www.goldderby.com/article/2022/christian-guardino-agt-golden-buzzer-american-idol/)! L'un des avantages de l'essor des réseaux sociaux est que même les patients atteints de maladies génétiques ultra-rares se sont regroupés, s'informent mutuellement et militent pour obtenir des traitements spécifiques à leur pathologie. Beaucoup de ces personnes se portent volontaires pour participer à des études complémentaires qui pourraient, un jour, soutenir un essai interventionnel (comme des études d'histoire naturelle, des évaluations de nouveaux critères de jugement, etc.). Elles savent que ces études individuelles ne leur apporteront pas de bénéfice direct, mais elles sont engagées dans la mission de trouver des traitements contre la cécité.
Un inconvénient de l'interface des réseaux sociaux est la diffusion de données non officielles – qu'elles soient positives ou négatives – avant toute revue critique et publication. Cela peut parfois entraîner une propagation rapide de désinformation inexacte et trompeuse, et détourner l'attention des recherches menées avec rigueur.
Variants de RPE65 et prédictions d'efficacité
Avant d'inclure un sujet dans un essai clinique ou de le traiter avec le Luxturna®, il était essentiel de déterminer si les variants de RPE65 détectés étaient effectivement des variants responsables de la maladie et non de simples variants bénins. En cas de variants bénins, le patient serait exposé à des risques inutiles (anesthésie, injection sous-rétinienne, etc.) sans aucune chance de bénéfice. Dans de nombreux cas, il existe des indications claires quant à la probabilité qu'un variant particulier de RPE65 soit pathogène (par opposition à un polymorphisme bénin). Ces indications proviennent d'analyses de ségrégation, de la localisation des modifications de l'acide nucléique par rapport à la protéine RPE65 isomérohydrolase, une molécule identifiée et caractérisée par T. Michael Redmond [24 , 25], ainsi que de logiciels de prédiction de variants tels que Polyphen2 et SIFT. En général, il n'est pas difficile de réaliser de telles analyses.
Cependant, dans certains cas, des variantes de signification inconnue (VUS) peuvent être identifiées. Voici quelques exemples de situations où cela peut se produire :
l'évaluation d'un enfant adopté sans parent biologique connu;
la découverte d'un problème de non-paternité lors des études de ségrégation;
la découverte d'un variant de novo .
Dans ces cas, des analyses supplémentaires sont justifiées. Yang et al. ont décrit une approche de mutagenèse in vitro pour vérifier la pathogénicité des variants avant l'administration d'une thérapie génique [26]. Chez une série de 4 patients pédiatriques, de nouveaux variants RPE65 , hétérozygotes composites ou homozygotes, de signification inconnue ont été identifiés. Ces variants génétiques ont été incorporés dans la protéine RPE65 en laboratoire et l'activité enzymatique de la protéine modifiée a été testée, révélant une abolition de cette activité. Cela a permis de confirmer que ces variants étaient bien pathogènes. Les sujets ont été traités par Luxturna® et chacun a montré une amélioration, constituant la preuve définitive que leurs mutations étaient responsables de la maladie.
Les anticorps neutralisants anti-AAV2 préexistants n'empêchent pas l'efficacité après une injection sous-rétinienne
Lorsque nous avons lancé notre essai clinique de phase I de thérapie génique RPE65 au CHOP, nous ignorions s'il était sûr d'inclure des sujets précédemment immunisés contre l'AAV sauvage. La preuve d'une exposition antérieure se manifestait par la présence d'anticorps sériques dirigés contre la capside AAV2. De nombreuses personnes sont exposées à l'AAV2 sauvage durant l'enfance [27]. Ces individus pourraient-ils bénéficier de l'intervention ou la transduction serait-elle bloquée par des anticorps neutralisants? Une réponse immunitaire accrue pourrait-elle entraîner une toxicité? Les anticorps neutralisants anti-AAV2 (Nabs) ont une prévalence de 30 % à 40 % dans la population, mais ce pourcentage varie selon les régions géographiques [28-29-30]. En Afrique, par exemple, la prévalence peut atteindre 60 % [ 31]. Nous avons décidé d'exclure les participants présentant des Nabs anti-AAV2 à un titre supérieur à 1:1000 dans nos études de phase I. Ce seuil d'exclusion a été choisi sur la base de l'expérience antérieure avec l'administration systémique d'AAV2 dans des essais de thérapie génique pour l'hémophilie.
Après avoir terminé nos études de phase I, nous avons consulté la FDA pour savoir s'il serait approprié d'utiliser l'œil controlatéral non injecté comme témoin dans les études de phase III prévues. Ils ont répondu par la négative, précisant que les deux yeux devaient être injectés. Selon les conceptions biostatistiques traditionnelles utilisées dans les essais approuvés par la FDA, ce sont les sujets, et non les yeux ou les organes, qui doivent servir de témoins. De plus, il était probable que de nombreux cliniciens tenteraient de traiter le deuxième œil une fois le médicament approuvé. Nos études précliniques et cliniques nous avaient appris qu'une injection sous-rétinienne unilatérale provoquait une réponse systémique en Nabs anti-AAV2. Cependant, nous ne savions pas si cela empêcherait une réinjection dans l'œil controlatéral. Nous avons donc été chargés d'évaluer la sécurité de l'administration d'AAV2.hRPE65v2 dans l'œil controlatéral.
Nous avons mené des études précliniques sur des chiens atteints et des primates non humains non atteints, en administrant une dose élevée d'AAV par voie sous-rétinienne, puis en traitant l'œil controlatéral avec la même dose élevée au moment où la réponse immunitaire était maximale. Nous avons également immunisé systémiquement les primates non humains avec de l'AAV avant l'injection sous-rétinienne pour simuler une situation où les humains auraient des anticorps neutralisants à haut titre. Enfin, nous avons évalué les niveaux d'anticorps anti-AAV2 dans le liquide intraoculaire et le sérum de patients (non porteurs de variants sur RPE65 ) subissant une chirurgie de la cataracte, afin de déterminer si des niveaux élevés d'anticorps sériques correspondaient à des niveaux élevés d'anticorps dans le liquide intraoculaire.
Nous avons constaté qu'il était sûr de réaliser des injections sous-rétiniennes de 1,5×10 11 vg d'AAV2.hRPE65v2 chez des animaux présentant des Nabs anti-AAV2 préexistants, et qu'il était également sûr de réadministrer 1,5E11 vg d'AAV2.hRPE65v2 dans l'œil controlatéral des animaux, même lorsque la réponse immunitaire était maximale [13]. Nous avons également découvert que le liquide intraoculaire chez l'humain est isolé des anticorps présents dans la circulation. De même, le liquide intraoculaire des animaux est isolé des anticorps humoraux, du moins jusqu'à ce que cet œil soit directement exposé à l'AAV2. Nous avons donc procédé avec prudence à la réadministration d'AAV2.hRPE65v2 dans l'œil controlatéral de nos sujets de phase I dans une étude de suivi. Nous avons observé que la réadministration sous-rétinienne dans l'œil controlatéral était sûre, et qu'elle entraînait le même niveau d'amélioration de la fonction rétinienne et visuelle que dans l'œil initialement injecté [ 32 , 33]. Nous avons supprimé le critère d'exclusion lié à la présence de Nabs anti-AAV2 humoraux dans notre essai clinique de phase III.
Aucun cas d'inflammation due au vecteur n'a été observé en phase III, quel que soit le niveau de Nabs anti-AAV2. Actuellement, le traitement des individus avec le Luxturna® ne tient pas compte de leur statut immunitaire vis-à-vis de l'AAV2. Des études supplémentaires en laboratoire soutiennent la sécurité d'une réinjection sous-rétinienne dans l'œil initialement injecté [34], bien que cela n'ait pas encore été testé chez l'humain atteint de la maladie RPE65 . Cela diffère de l'expérience dans les maladies non oculaires, où la réadministration peut ne pas être bénéfique.
Il convient de noter que l'administration d'AAV dans la cavité intravitréenne n'est pas nécessairement aussi sûre sur le plan des anticorps que l'injection sous-rétinienne. L'administration intravitréenne de fortes doses d'AAV (et d'autres vecteurs viraux) est plus susceptible de provoquer une inflammation, peut-être parce que certains AAV ciblent les structures du segment antérieur (voir ci-dessus) [ 17 , 35 , 36]. Une inflammation a été observée après une injection intravitréenne d'AAV8 dans un essai sur le rétinoschisis lié à l'X (promoteur : NEI/NIH), chez certains sujets traités avec de l'AAV2 dans des essais sur la neuropathie optique héréditaire de Leber (Gensight Biologics) et chez des sujets traités avec l'ADVM-022, un AAV7m8 délivrant l'ADNc codant pour l'aflibercept (Adverum®) [37-38-39]. L'essai clinique d'Adverum® exclut désormais les individus présentant des Nabs sériques > 1:125. À l'avenir, il sera également important de mener des analyses sur l'association entre les réponses immunitaires cellulaires et l'inflammation intravitréenne afin de mieux comprendre et de réduire les risques de cette voie d'administration.
Prévenir la transmission mère-enfant
L'une des principales préoccupations de la FDA dans les premières études était de savoir si le vecteur injecté par voie sous-rétinienne pouvait entrer en contact avec des sites systémiques et les infecter. Une inquiétude particulière concernait l'exposition des gonades (testicules et ovaires), l'infection des spermatozoïdes ou des ovules, et donc la transmission du vecteur à la génération suivante lors de la fécondation. Aucune de nos données de laboratoire ou précliniques (obtenues selon les BPL) après administration sous-rétinienne d'AAV ne soutenait cette possibilité. Néanmoins, nous avons été tenus d'informer tous les sujets de nos études de phase I, y compris les enfants de 8 ans, qu'ils devaient utiliser une contraception pendant au moins un an après la chirurgie.
Lors de nos réunions avec les autorités réglementaires pour discuter de certaines études de réadministration proposées, nous avons été surpris lorsque les éthiciens de la FDA nous ont indiqué que nous empiétons sur les libertés de nos sujets. Nos études de suivi et notre essai de phase III ont donc permis aux individus de décider eux-mêmes s'ils souhaitaient utiliser une contraception, et ce à partir de 4 mois après l'administration du vecteur.
Les aléas des critères d'évaluation
Dans nos études initiales utilisant 3 chiens Briard atteints, puis dans des études ultérieures avec des chiens atteints d'âges différents et traités avec diverses formulations d'AAV et transgènes, nous avons utilisé une variété de critères d'évaluation pour mesurer la restauration réussie de la vision. Plusieurs mesures non invasives semblaient informatives, notamment les électrorétinogrammes (ERG) [10-11-12], la pupillométrie [ 11], les tests de nystagmus [ 12 , 40 , 41], et la navigation dans un labyrinthe en lumière tamisée [10 , 12]. Les ERG et les réflexes pupillaires à la lumière ( pupillary light responses [PLR]) s'amélioraient également lorsque des souris étaient traitées par AAV2.hRPE65v2 [ 12 , 42]. Nous avons donc intégré toutes ces mesures comme critères exploratoires dans notre essai clinique de thérapie génique de phase I au CHOP. Dans cet essai de phase I, un seul œil (le plus atteint) était traité par AAV2.RPE65v2, ce qui nous permettait de comparer les résultats entre les yeux traités et non traités (témoins).
Notamment, la seule mesure qui n'a pas été utile chez l'humain était l'ERG. Cette mesure avait pourtant été robuste chez les chiens atteints et avait même servi à justifier la stratégie de dosage mise en œuvre dans trois essais cliniques différents de thérapie génique RPE65 [43 , 44]. Les autres mesures, y compris la pupillométrie, les tests de nystagmus et la navigation, ont donné des résultats robustes dans notre essai clinique de phase I au CHOP.
À l'inclusion, les PLR étaient plats : les pupilles ne se contractaient pas sous l'effet de la lumière. Les PLR se sont améliorés chez tous les sujets dès 8 jours après l'injection [ 32]. Comme le PLR est consensuel, lorsque l'œil traité était exposé à la lumière, les deux pupilles se contractaient. En revanche, lorsque l'œil non traité était exposé à la lumière, aucune pupille ne se contractait. L'amplitude de la contraction était corrélée à l'intensité des stimuli lumineux. L'effet était analogue à ce qui est observé cliniquement comme un défaut pupillaire afférent ( afferent pupillary defect [APD]) – un œil répondant à la lumière, l'autre non. Cependant, dans ce cas, l'APD était présent dans l'œil non traité. Cette mesure a fourni les premières données objectives indiquant que l'intervention était efficace [45 , 46]. Plus tard, lors d'une étude de suivi où l'œil controlatéral était traité, le PLR a été restauré dans les deux yeux et l'« APD» a disparu [32 , 33 , 47].
Une amélioration de la fixation du regard a également été observée lors des tests de nystagmus. En fait, une meilleure stabilité oculaire pourrait expliquer une tendance à l'amélioration de l'acuité visuelle dans les yeux non traités [ 45]. Cependant, comme chez les chiens atteints, tous les sujets humains ne présentaient pas un nystagmus sévère à l'inclusion. La gravité du nystagmus est également influencée par le niveau de vigilance et divers médicaments, ce qui a conduit à ne pas approfondir cette mesure.
La capacité à se déplacer de manière autonome en utilisant uniquement la vue semblait être un critère d'évaluation « réel» à poursuivre. Nous avions montré que les chiens aveugles amélioraient leur capacité à naviguer dans des environnements sombres après la thérapie génique. Des résultats similaires ont été observés chez nos sujets de phase I atteints de RPE65 . À l'inclusion, ces individus avaient des difficultés à naviguer rapidement et avec précision dans un parcours d'obstacles, en particulier en lumière tamisée. Après le traitement, ils étaient capables d'éviter les collisions avec les obstacles et de marcher rapidement vers la sortie du parcours en utilisant leur œil traité. Leurs performances restaient inchangées lorsqu'ils utilisaient leur œil non traité.
Après avoir présenté les résultats prometteurs de notre essai clinique de phase I pour la carence en RPE65 lors d'une séance plénière à la réunion annuelle de l'Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) en 2008, la dernière question de l'audience a été : « Pourquoi n'avez-vous pas pu enregistrer d'ERG en champ complet?». Nous ne connaissons toujours pas la réponse à cette question. Nous avons tenté d'enregistrer des ERG multifocaux et avons observé un signal dans la zone injectée de la rétine d'un sujet, mais nous n'avons pas pu reproduire ce résultat chez d'autres sujets [48]. Le fait que les ERG en champ complet aient été restaurés chez les modèles animaux mais pas chez l'humain pourrait être lié aux différences de variants RPE65 . Les chiens atteints étaient tous homozygotes pour une délétion de quatre nucléotides (AAGA) entraînant un décalage du cadre de lecture et un codon stop prématuré [49 , 50]. Les souris atteintes présentaient soit un knock-out génétiquement induit de Rpe65 [ 24], soit un variant non-sens spontané dans l'exon 3 du gène Rpe65 [51]. En revanche, les humains souffraient de divers variants hétérozygotes composites ou homozygotes, mais aucun ne correspondait aux changements observés chez les Briards (ou les souris). Une autre explication possible est que la restauration des ERG chez les animaux pourrait être liée à l'âge développemental auquel les animaux ont été traités. Dans la plupart des études canines et murines, les animaux ont été traités tôt dans la vie (généralement à 4 mois pour le Briard et à 1 mois pour la souris) [10 , 12]. L'équivalent chez l'humain serait un traitement en très bas âge. Il se peut qu'il ne soit pas possible de restaurer les ERG en champ complet chez l'humain tant que des nourrissons ne seront pas inclus. Puisque le Luxturna® est désormais approuvé pour une utilisation chez les enfants dès 1 an, il pourrait être possible de tester cette hypothèse.
Finalement, la FDA nous a informés que, pour l'approbation du médicament, une mesure reflétant une « amélioration cliniquement significative» était requise, c'est-à-dire une mesure de l'activité de la vie quotidienne. Nous avons standardisé et validé un test de mobilité sous différentes luminances ( multi-luminance mobility test [MLMT]) pour évaluer la vitesse et la précision de la navigation sous des niveaux d'éclairement spécifiés [52]. Les performances utilisant les deux yeux ensemble et chaque œil individuellement étaient enregistrées par vidéo et les résultats analysés par un centre de lecture. Les résultats ont montré une amélioration robuste de la vision fonctionnelle et une corrélation avec d'autres mesures cliniques (sensibilité à la lumière en champ complet, champs visuels) et un questionnaire modifié sur la fonction visuelle [53 , 54]. Le MLMT a été considéré favorablement par rapport à l'exigence d'amélioration cliniquement significative. Un test physique similaire au MLMT (test Ora-VNC, Andover, MA, États-Unis) est désormais utilisé pour filmer et mesurer la vision fonctionnelle dans d'autres essais cliniques de thérapie génique pour les dégénérescences rétiniennes héréditaires. À l'avenir, il pourrait être possible de simplifier l'évaluation de l'impact de la thérapie génique (ou d'autres interventions) sur la vision fonctionnelle grâce à l'utilisation de tests fondés sur la réalité virtuelle [55]. Un tel système pourrait faciliter la réalisation du test et permettre de l'adapter à différentes maladies rétiniennes. De plus, un score automatisé des tests pourrait fournir des résultats rapides et objectifs, sans risque de divulgation d'identifiants personnels.
Les perspectives de bénéfice évoluent-elles avec l'âge?
Nos données précliniques d'ERG obtenues à partir de modèles animaux indiquaient que le bénéfice était maximal chez les jeunes animaux, tant chez les souris que chez les chiens. La restauration de la fonction rétinienne était bien plus importante et un pourcentage plus élevé d'animaux répondait dans les cohortes de souris âgées de 2 à 4 mois que dans celles de souris âgées (plus de 15 mois). De même, les réponses en ERG étaient meilleures après le traitement des chiots que des chiens d'âge moyen [ 56]. Nous avons donc proposé d'inclure des enfants dans notre essai clinique de phase I.
Comme les enfants n'avaient jamais été inclus auparavant dans des essais cliniques de thérapie génique pour des maladies non mortelles, notre proposition a été sélectionnée pour une réunion complète du Comité consultatif sur l'ADN recombinant (RAC) du National Institutes of Health (NIH). Étant donné que l'administration de la thérapie génique implique une anesthésie et une chirurgie, elle présente plus qu'un risque minimal. Selon la loi 21 CFR 50.52, avant d'initier une étude chez l'enfant, il faut apporter la preuve que l'administration de l'agent étudié offre une perspective de bénéfice direct. Par conséquent, la préférence traditionnelle pour inclure d'abord les adultes s'appliquait fortement. Nous avons expliqué notre raisonnement pour l'inclusion des enfants et le choix de la dose, qui prévoyait une efficacité possible à faible dose, avec un plan pour d'abord tester la sécurité et l'efficacité chez les adultes, puis inclure les enfants (âgés de 8 ans et plus). Le RAC a approuvé à l'unanimité notre plan. Il est intéressant de noter qu'une fois notre étude approuvée pour inclure des sujets pédiatriques, d'autres essais cliniques de thérapie génique rétinienne ont pu en bénéficier par effet de filiation.
Nous avons effectivement démontré une efficacité spectaculaire chez les enfants, mais ce qui a peut-être été encore plus surprenant, c'est que nous avons également observé une efficacité chez des adultes d'âge moyen présentant une maladie avancée. Les améliorations étaient généralement plus difficiles à mesurer avec les critères standard de la fonction visuelle (comme l'acuité visuelle), car il ne restait que des îlots de photorécepteurs viables. Il faut noter que l'imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf) a documenté une augmentation du flux sanguin vers les régions du cortex visuel prédites pour être activées après l'administration d'AAV dans la portion pertinente de la rétine [33 , 47 , 57]. Il y avait même des bénéfices structurels (myélinisation) accompagnant les bénéfices fonctionnels [57]. Ces résultats ont révélé que, même si la voie visuelle n'avait pas été utilisée depuis des décennies chez ces individus « aveugles», le « câblage» était présent et pouvait être sollicité si la réactivité à l'entrée stimulatrice rétinienne était rétablie.
En raison du faible nombre d'individus inclus dans les études de phase III ( n = 29), toute analyse de l'effet de l'âge est statistiquement sous-alimentée. Pour cette raison et du fait des nombreuses autres variables impliquées, nous n'avons pas encore déterminé de manière définitive si l'intervention est plus efficace et durable chez les enfants que chez les adultes, mais cette question est en cours d'examen. Il existe cependant des rapports post-approbation faisant état d'excellents résultats chez des sujets jeunes et d'âge moyen [ 58 , 59]. Ainsi, la morphologie de la rétine semble être un meilleur prédicteur des résultats que l'âge. Toutefois, si la rétine est « corrigée» trop tard dans la vie, l'individu peut ne pas pouvoir bénéficier de la vision en raison d'une amblyopie (c'est-à-dire que le cerveau peut ne pas reconnaître les informations transmises par la rétine).
Considérations chirurgicales et expérience post-commercialisation
Avant de mener l'essai clinique de phase III multicentrique sur RPE65, les expériences acquises lors des nombreuses études animales et chez les sujets humains ont été assimilées pour élaborer une procédure opérationnelle standard détaillée, visant à maximiser la sécurité et le bénéfice potentiel. Le protocole précisait la dose, le volume et la distance par rapport à la fovéa (afin de minimiser le stress sur cette zone vulnérable). Après l'approbation de la FDA, Spark Therapeutics a mis en place un programme de formation à l'injection sous-rétinienne intégrant de nombreux détails que nous avions précédemment partagés avec Novartis dans un manuel d'injection sous-rétinienne. Des chirurgiens rétiniens certifiés ont bénéficié d'une formation théorique et pratique en laboratoire, puis ont été qualifiés pour participer dans des centres d'excellence autorisés à administrer le Luxturna®.
Plusieurs groupes ont depuis rapporté certains de leurs résultats, une démarche inestimable pour partager à la fois les expériences positives et négatives. Certains décrivent les premières expériences dans leurs pays respectifs avec un nombre limité de patients [60-61-62-63]. D'autres rapportent les résultats d'une série de patients. La plupart des chercheurs signalent une amélioration de la fonction rétinienne et visuelle dans l'année suivant le traitement, en accord avec les résultats des essais cliniques [58 , 64]. Gange et al. rapportent une atrophie choriorétinienne périfovéale progressive (au site d'injection) après la chirurgie dans 80 % des yeux, certains présentant des scotomes liés à cette atrophie [65]. Sengillo et al. ont traité 41 patients, dont 25 pédiatriques [ 59]. Ils rapportent une amélioration de l'acuité visuelle chez les patients pédiatriques, une tendance observée dans notre groupe d'étude initial [ 53].
Un détail ressort de l'examen des différents résultats des études post-commercialisation : les différents chirurgiens ont varié la technique chirurgicale, notamment en ce qui concerne la création ou non d'un décollement préliminaire avec une solution saline équilibrée, l'emplacement du décollement, l'utilisation ou non de l'OCT pendant la procédure d'injection sous-rétinienne, la réalisation ou non de plusieurs décollements, le moment du traitement du deuxième œil, etc. Nous avions précédemment décrit une procédure en deux étapes, où deux injections sont placées à distance de la fovéa, puis le décollement est laissé « rouler» vers la fovéa par gravité après un échange liquide-air [66]. Testa et al. ont retardé l'injection du deuxième œil à 45 jours, apparemment en raison d'une complication hémorragique rétinienne survenue dans le premier œil [60]. Auparavant, l'intervalle maximal recommandé entre l'injection du premier et du deuxième œil était de 18 jours. On peut se demander si l'augmentation du temps entre la première et la deuxième injection, ainsi que d'autres variables dans les différentes études affecteront les résultats globaux. Jusqu'à présent, la plupart des rapports indiquent que les réponses inflammatoires restent minimes. Nous encourageons les différents groupes à publier tous les détails de leurs études (y compris toute fuite au niveau du site de rétinotomie dans le vitré, les difficultés à soulever le décollement, ou d'autres complications) afin que le domaine (et les patients) puisse en bénéficier.
Il sera particulièrement intéressant de savoir s'il y a plus de bénéfices lorsque l'intervention est administrée chez les nourrissons et les tout-petits que chez les individus plus âgés. Les études de phase III étaient ouvertes aux individus âgés de 3 ans et plus. Cependant, le plus jeune individu ayant reçu l'intervention dans cette étude avait 4 ans. L'EMA et la FDA nous ont surpris en autorisant le traitement des enfants dès l'âge de 1 an. Jusqu'à présent, nous avons entendu parler d'au moins deux enfants de 2 ans qui ont été traités : l'un par Sengillo et al. [59] et l'autre par notre équipe au CHOP. Les deux individus ont bien répondu à la thérapie génique. Bien sûr, il est difficile d'obtenir des mesures quantitatives de la fonction visuelle rétinienne chez de si jeunes patients, en particulier à l'inclusion. Peut-être observera-t-on une restauration des ERG en champ complet chez ces individus (voir ci-dessus). Sinon, à mesure qu'ils grandiront, il sera peut-être possible de comparer les réponses dans les zones traitées et non traitées de leur rétine afin d'évaluer l'effet de l'âge sur les résultats du traitement.
Remarques conclusives : l'expérience RPE65 et son extrapolation à d'autres dégénérescences rétiniennes héréditaires
Le Luxturna® a introduit le concept d'un traitement génique unique pour une maladie auparavant incurable, tant pour les patients que pour les médecins. Grâce aux progrès dans l'identification des gènes et des variants responsables de maladies, d'autres maladies rétiniennes sont désormais explorées comme cibles pour la thérapie génique. Les stratégies d'antisens et d'édition génique viennent compléter les approches d'augmentation génique. Les études de thérapie génique se sont élargies pour inclure les voies de la maladie et neurosensorielles comme cibles. Il existe dorénavant des programmes évaluant la thérapie génique antinéovasculaire et optogénétique, et une entreprise prépare même un traitement génique pour les dégénérescences rétiniennes héréditaires, indépendant du gène ou du variant génétique responsable.
À mesure que le domaine avance, nous en apprenons davantage sur les promesses et les limites des vecteurs de livraison, les limites de sécurité et les réponses immunitaires. La rétine est devenue une cible très attrayante pour la thérapie génique, en raison des avantages inhérents à ce tissu (immunologiques, anatomiques, conception statistique, etc.). Le défi actuel consiste à progresser de manière prudente pour réduire les risques des nouvelles stratégies, afin de continuer à offrir des options de traitement durables et innovantes pour des maladies dévastatrices.
III. Thérapie par édition du génome dans les dystrophies rétiniennes d'origine génétique
I. Audo, T. Ben Yacoub, L. Pereira, J. Wohlschegel, C. Zeitz, J.-A. Sahel
Contexte
Les vecteurs AAV ( adeno-associated virus ) constituent aujourd'hui l'outil de référence pour les approches de thérapie génique par remplacement de gène, notamment en raison de leur faible immunogénicité, ainsi que de leur forte affinité et de leur efficacité à transduire les cellules rétiniennes. Cependant, cette stratégie présente des limites; en particulier, la capacité d'empaquetage des AAV est restreinte (environ 4,5 kb), largement en deçà de la séquence codante de gènes majeurs dans les dystrophies rétiniennes héréditaires (DRH), tels que ABCA4 (dont les variants pathogènes sont responsables de la maladie de Stargardt et une cause majeure de dystrophie de type cône-bâtonnet), USH2A (dont les variants pathogènes sont une cause majeure de dystrophie de type bâtonnet-cône ou rétinopathie pigmentaire [RP] et de syndrome d'Usher de type 2), EYS , associé à la RP, ou encore CEP290 (dont les variants pathogènes sont une cause majeure d'amaurose congénitale de Leber et de syndrome de Joubert). Cette capacité d'empaquetage est augmentée dans le cas des lentivirus, rétrovirus capables de transporter jusqu'à 9 kb environ.
Cependant, ces virus sont potentiellement intégratifs, ce qui implique des risques d'insertion dans des régions régulatrices essentielles au contrôle de la croissance cellulaire notamment. De plus, leur tropisme pour les photorécepteurs et l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) demeure incertain, et leur capacité d'empaquetage reste insuffisante pour de très grands gènes comme USH2A .
Une alternative pour dépasser la limite de capacité d'empaquetage des AAV consiste à utiliser deux vecteurs viraux (approche par vecteurs duaux), dans lesquels la séquence du transgène est scindée en deux cassettes distinctes, chacune insérée dans un AAV [ 69]. Chaque vecteur contient une portion du transgène flanquée d'éléments de jonction permettant la reconstitution intracellulaire de la séquence codante complète lorsqu'une même cellule est co-transduite. Parmi les systèmes employés, les intéines (protéines ou domaines protéiques capables d'exciser et de ligaturer des segments polypeptidiques) permettent une recombinaison post-traductionnelle de deux demi-protéines, assurant une reconstitution précise de la protéine cible. D'autres approches de double vecteurs reposent sur la recombinaison homologue ou la concatémérisation (assemblage) guidée par les ITR ( inverted terminal repeats , séquences d'ADN répétées aux deux extrémités du génome d'un AAV). Les systèmes à intéines ont l'avantage de permettre une reconstitution protéique indépendante de la structure concatémérisée du génome vectoriel. Ces stratégies de doubles vecteurs font actuellement l'objet d'un développement clinique ( www.clinicaltrials.gov , NCT07161544, NCT06591793, NCT06942572).
Toutefois, même avec un système dual, la taille cumulée de certains gènes, comme USH2A ou EYS , dépasse encore la capacité totale que l'on peut raisonnablement diviser et reconstituer via deux vecteurs AAV, limitant l'applicabilité de cette approche pour les gènes dont la séquence codante excède largement les seuils de tolérance des génomes AAV recombinants. Par ailleurs, cette approche n'est pertinente que pour les variants entraînant une perte de fonction; elle est inadaptée aux variants à effet dominant négatif ou toxique.
Dans ce contexte, les nouvelles technologies d'ingénierie du génome offrent des solutions complémentaires permettant soit l'inactivation d'un allèle délétère, soit la correction précise d'une séquence pathogène. Toutes reposent sur des systèmes très similaires d'endonucléases capables d'induire une cassure contrôlée des brins d'ADN, cassure réparée ensuite par la machinerie cellulaire.
Mécanismes de réparation des cassures doubles brins d'ADN
Pour rappel, le patrimoine génétique d'une cellule est contenu dans son ADN, structure en double hélice, constituée de deux brins complémentaires formés chacun d'un enchaînement de bases azotées, ou nucléotides, nécessaire à la conservation et la transmission de l'information génétique. Toute une machinerie cellulaire existe pour corriger d'éventuelles cassures du double brin ( doublestrand break [DSB]) qui surviennent notamment au cours de la division cellulaire, afin de préserver l'intégrité génomique. La cellule présente deux stratégies principales de réparation de ces DSB :
la réparation par jonctions d'extrémités non homologues ( non-homologous end joining [NHEJ]);
et la réparation par recombinaison homologue dirigée ( homology-directed repair [HDR]).
La correction des DSB via NHEJ est une voie rapide mais imprécise; elle entraîne l'ajout ou la délétion aléatoire de nucléotides, altérant fréquemment le cadre de lecture. Elle conduit le plus souvent à la production d'une protéine tronquée ou à un knock-out fonctionnel du gène. La stratégie HDR, quant à elle, exploite un brin matrice homologue (chromatide sœur ou oligonucléotide donneur, ssODN ou single-stranded oligodeoxynucleotide ) pour restaurer précisément la séquence [70]. Cette option est particulièrement pertinente pour la correction génique, bien que majoritairement active dans les cellules en division. L'association d'une endonucléase ciblée et d'un donneur ssODN permet ainsi d'induire une réparation HDR dirigée, autorisant la correction précise ou l'introduction d'une séquence spécifique [71].
Endonucléases comme outils d'édition du génome
Les nouvelles techniques de thérapie génique, mettant en jeu l'action d'endonucléases, reposent sur le principe d'induction d'une cassure à un niveau précis de l'ADN, suivie d'une des stratégies de réparation énoncées précédemment. Les endonucléases utilisées sont alors formées de deux domaines :
un domaine de reconnaissance et de liaison spécifique à une séquence génomique d'intérêt;
et un domaine de coupure de l'ADN (la nucléase) qui se charge de créer la cassure.
Les première familles d'endonucléases utilisées incluaient les nucléases en doigts de zinc ( zinc finger nucleases ), puis les TALEN ( transcription activator-like effectors ) qui ont fait l'objet de plusieurs essais thérapeutiques. Cependant, leur utilisation n'est pas dénuée de contraintes, notamment par leur manque de flexibilité en termes de choix de séquence d'ADN cible, leur coût et la longueur de leur mise en place. Ces endonucléases ont été supplantées depuis la découverte des CRISPR ( clustered regularly interspaced short palindromic repeats ).
En 1987, des chercheurs découvrent chez Escherichia coli des régions d'ADN particulières formées d'une succession de courtes séquences répétées et séparées par des séquences uniques appelées spacers [ 72]. Ces structures, qui ont ensuite été nommées CRISPR, sont retrouvées dans près de la moitié des bactéries et dans la grande majorité des archées. Il a par la suite été montré que les spacers ne proviennent pas du génome de la bactérie, mais de l'ADN de virus (bactériophages) ayant infecté la cellule auparavant. Les CRISPR fonctionnent donc comme un système d'immunité adaptative : la bactérie conserve sous forme de spacers des fragments d'ADN viral, ce qui lui permet de reconnaître et de neutraliser plus rapidement un virus identique lors d'une nouvelle infection.
Puis, deux équipes de recherche, l'une conduite par Jennifer Doudna (professeur à l'Université de Californie, Berkeley, États-Unis) et l'autre par Emmanuelle Charpentier (directrice de l'Institut Max Planck, Berlin, Allemagne), ont démontré pour la première fois que le système CRISPR/Cas pouvait être utilisé pour le clivage d'un ADN cible in vivo, et induire une édition du génome [73]. Cette découverte majeure, applicable à n'importe quel organisme vivant, leur a valu le prix Nobel de chimie en 2020.
Édition génomique par CRISPR/Cas9
L'outil moléculaire CRISPR/Cas9 est composé de deux éléments nécessaires à l'édition génomique :
une enzyme, la Cas9, faisant office d'endonucléase munie de deux sites de clivage, RuvC et HNH, qui effectue une cassure des doubles brins de l'ADN (fig. 45-4
Fig. 45-4Schéma de l'assemblage CRISPR/Cas9 induisant une cassure double brin de l'ADN cible et mécanismes de réparation. Deux éléments sont nécessaires à l'édition génomique : la Cas9, endonucléase munie de deux sites de clivage, RuvC et HNH, et un ARN guide (ARNg). La Cas9 se fixera en présence d'un motif PAM (protospacer adjacent motif) en aval. Les sites catalytiques RuvC et HNH de la Cas9 clivent chaque brin d'ADN, ce qui déclenche le recrutement de la machinerie cellulaire de réparation de l'ADN par NHEJ ou non-homologous end joining. La synthèse d'un brin d'ADN à partir d'une matrice (brin d'ADN complémentaire ou donneur simple brin exogène ssODN, ou single-stranded oligodeoxynucleotide) favorise une réparation plus fidèle par HDR ou homology-directed repair.
Source : dessin de Cyrille Martinet.
);
un ARN guide (ARNg), qui condense les deux ARN, ARNcr et ARNtracr, qui va guider spécifiquement la Cas9 vers son site de clivage.
Cet ARN est composé d'une séquence variable de 20 nucléotides complémentaires à une séquence contenue sur la portion du génome ciblé et d'une séquence constante de 42 nucléotides servant de fixation de la Cas9.
Un prérequis dans le choix de la séquence cible est la présence en aval d'un motif PAM ( protospacer adjacent motif ) constitué, pour la Cas9, de 3 nucléotides (5′-NGG-3′ ou éventuellement 5′-NAG-3′) essentiels à la fixation de la Cas9 (trois nucléotides en gris sur la fig. 45-4
Fig. 45-4Schéma de l'assemblage CRISPR/Cas9 induisant une cassure double brin de l'ADN cible et mécanismes de réparation. Deux éléments sont nécessaires à l'édition génomique : la Cas9, endonucléase munie de deux sites de clivage, RuvC et HNH, et un ARN guide (ARNg). La Cas9 se fixera en présence d'un motif PAM (protospacer adjacent motif) en aval. Les sites catalytiques RuvC et HNH de la Cas9 clivent chaque brin d'ADN, ce qui déclenche le recrutement de la machinerie cellulaire de réparation de l'ADN par NHEJ ou non-homologous end joining. La synthèse d'un brin d'ADN à partir d'une matrice (brin d'ADN complémentaire ou donneur simple brin exogène ssODN, ou single-stranded oligodeoxynucleotide) favorise une réparation plus fidèle par HDR ou homology-directed repair.
Source : dessin de Cyrille Martinet.
). À l'état libre, la Cas9 s'auto-inhibe et n'est donc pas capable de se fixer sur l'ADN pour exercer sa fonction d'endonucléase. Suite à sa fixation à l'ARNg, la Cas9 subit un réarrangement physique lui permettant d'adopter une conformation la rendant capable de se fixer sur l'ADN cible avec le motif PAM. Une fois le complexe Cas9/ARNg fixé sur l'ADN, les sites catalytiques RuvC et HNH de la Cas9 clivent chaque brin d'ADN. Cette coupure double brin déclenche une succession d'événements, avec le recrutement de la machinerie cellulaire de réparation de l'ADN. Cela implique le recrutement d'enzymes (glycosylases, endonucléases et exonucléases) permettant un réarrangement nucléotidique. Une ADN polymérase est recrutée pour l'ajout de manière aléatoire de nucléotides dans le cas de la stratégie NHEJ (séquence en rouge sur la fig. 45-4
Fig. 45-4Schéma de l'assemblage CRISPR/Cas9 induisant une cassure double brin de l'ADN cible et mécanismes de réparation. Deux éléments sont nécessaires à l'édition génomique : la Cas9, endonucléase munie de deux sites de clivage, RuvC et HNH, et un ARN guide (ARNg). La Cas9 se fixera en présence d'un motif PAM (protospacer adjacent motif) en aval. Les sites catalytiques RuvC et HNH de la Cas9 clivent chaque brin d'ADN, ce qui déclenche le recrutement de la machinerie cellulaire de réparation de l'ADN par NHEJ ou non-homologous end joining. La synthèse d'un brin d'ADN à partir d'une matrice (brin d'ADN complémentaire ou donneur simple brin exogène ssODN, ou single-stranded oligodeoxynucleotide) favorise une réparation plus fidèle par HDR ou homology-directed repair.
Source : dessin de Cyrille Martinet.
), ou pour la synthèse d'un brin d'ADN à partir d'une matrice (brin d'ADN complémentaire ou donneur simple brin exogène ssODN) dans le cas de la stratégie HDR (nouvel ADN, voir fig. 45-4
Fig. 45-4Schéma de l'assemblage CRISPR/Cas9 induisant une cassure double brin de l'ADN cible et mécanismes de réparation. Deux éléments sont nécessaires à l'édition génomique : la Cas9, endonucléase munie de deux sites de clivage, RuvC et HNH, et un ARN guide (ARNg). La Cas9 se fixera en présence d'un motif PAM (protospacer adjacent motif) en aval. Les sites catalytiques RuvC et HNH de la Cas9 clivent chaque brin d'ADN, ce qui déclenche le recrutement de la machinerie cellulaire de réparation de l'ADN par NHEJ ou non-homologous end joining. La synthèse d'un brin d'ADN à partir d'une matrice (brin d'ADN complémentaire ou donneur simple brin exogène ssODN, ou single-stranded oligodeoxynucleotide) favorise une réparation plus fidèle par HDR ou homology-directed repair.
Source : dessin de Cyrille Martinet.
). Selon le brin donneur ssODN, la stratégie HDR peut permettre la correction d'un variant pathogène ou la modification du gène pour l'invalider, ou lui ajouter une nouvelle séquence. Dans ce contexte, le brin donneur ssODN synthétique doit contenir des séquences de nucléotides homologues à celles qui encadrent le site de coupure. Entre ces deux séquences, le brin donneur peut contenir la séquence normale du gène s'il s'agit de corriger un variant pathogène, ou tout autre séquence s'il s'agit d'inactiver le gène ou d'insérer une séquence entière dans un gène.
Applications
Les CRISPR se sont vite imposées comme outil moléculaire très efficace par rapport aux anciennes technologies de transgenèse, pour modifier le génome d'une cellule en culture, ou pour la création de nouveaux modèles animaux soit pour invalider un gène ( knock-out ), soit pour corriger un variant génétique, soit pour modifier l'expression d'un gène. Elles constituent donc un outil expérimental incontournable. Dans des approches de modélisation de pathologies à l'aide de cellules souches pluripotentes induites ( induced pluripotent stem cells [iPSC]), l'édition du génome de cellules dérivées de patients permet d'obtenir un contrôle isogénique précieux pour les études de physiopathologie [65-66-67].
Les CRISPR ont également un potentiel thérapeutique intéressant, et plusieurs études précliniques ont démontré leur capacité à corriger des variants pathogènes et à restaurer la fonction visuelle dans des modèles animaux de RP [ 77 , 78].
La première étude clinique, l'étude BRILANCE ( www.clinicaltrials.gov ; NCT03872479), de phase I-II, a évalué la sécurité et les premiers signes d'efficacité d'EDIT-101, une thérapie génique CRISPR/Cas9, empaquetée dans un AAV injecté en sous-rétinien, pour cibler le variant pathogène intronique profond (c.2991+1655A>G) dans l'intron 26 du gène CEP290 responsable d'une amaurose congénitale de Leber. Quatorze participants, dont 12 adultes et 2 enfants, ont reçu différentes doses de la préparation virale. L'étude a démontré la bonne tolérance de l'approche par CRISPR/Cas9. De plus, une amélioration de certains paramètres de la fonction visuelle a été observée chez certains participants : six d'entre eux ont montré une amélioration significative de la vision médiée par les cônes, notamment sur le test full-field stimulus threshold (FST), et cinq parmi ces derniers ont également présenté une amélioration dans d'autres mesures fonctionnelles. Au total, neuf participants ont montré une amélioration dans au moins un paramètre visuel, comme l'acuité visuelle, la sensibilité lumineuse en FST ou la performance au test de mobilité. Six participants ont aussi rapporté une amélioration notable de leur qualité de vie liée à la vision. Globalement, ces résultats suggèrent que l'édition génique CRISPR in vivo avec EDIT-101 est sûre et pourrait offrir des bénéfices fonctionnels, à documenter dans une étude ultérieure de phase III [79].
Malheureusement, à ce jour, le promoteur de l'étude BRILANCE ne semble pas vouloir poursuivre le développement de cette molécule. Toutefois, cette première étude de thérapie par CRISPR/Cas9, qui a démontré la sécurité d'une telle approche, ouvre des possibilités pour d'autres formes de DRH, notamment celles associées à un gène trop grand pour être empaqueté dans un AAV, ou à un variant exerçant un effet toxique.
Limites des CRISPR/Cas9
Bien que l'approche par CRISPR/Cas9 représente une avancée majeure en biotechnologie, plusieurs limites pourraient encore restreindre son utilisation clinique et thérapeutique. L'un des principaux obstacles est le risque d'effets hors cibles (ou OFF-target ), c'est-à-dire des coupures involontaires dans le génome susceptibles de provoquer des mutations indésirables ou des réarrangements délétères. L'efficacité de l'HDR a été démontrée dans des cellules en division comme les iPSC, mais le rendement de cette stratégie permettant une correction fidèle reste très limité dans les cellules post-mitotiques comme les cellules rétiniennes.
Par ailleurs, la nécessité d'avoir un motif PAM en aval du site de fixation de la Cas9 peut constituer une contrainte pour le choix d'une séquence cible ne permettant pas de corriger n'importe quelle séquence génomique. De plus, les stratégies in vivo actuelles emploient des AAV dont la cassette d'expression code pour l'ARNg et la Cas9. La séquence nucléotidique résultante représente une taille significative qui peut atteindre la limite d'empaquetage d'un AAV.
Des alternatives aux solutions virales ont été envisagées et testées avec succès in vitro. Notamment, l'apport de la Cas9 directement sous la forme d'une ribonucléoprotéine ou d'une protéine encapsulée serait efficace d'emblée et à demi-vie limitée, ce qui limiterait aussi les effets off-target . Pour sa part, l'ARNg pourrait être apporté de façon synthétique, ou bien dans un plasmide ou virus. Autant ces stratégies sont applicable in vitro, autant la délivrance efficace directement d'une protéine Cas9 in vivo pour cibler les photorécepteurs n'apparaît pas une stratégie envisageable.
Ces limites ont mené au développement de nouvelles stratégies comme le base editing , le prime editing , la synthèse de Cas de plus petite taille et des vecteurs alternatifs, qui commencent à étendre le champ des applications possibles tout en améliorant la précision, la sécurité et l'efficacité de l'édition génomique.
Nouveaux outils d'édition du génome
Base editing
Des avancées récentes portent sur une nouvelle classe d'outils d'édition génique capables d'éditer l'ADN simple sans former de cassures double brin et sans nécessiter une réparation par HDR. Appelés éditeurs de bases ( base editors ), ces outils incluent : les éditeurs de bases cytosine ( cytosine base editors [CBE]), constitués d'une Cas9 catalytiquement inactivée (dCas9) liée à une cytosine désaminase (rAPOBEC1), et des éditeurs de bases adénine ( adenine base editors [ABE]), constitués d'une dCas9 liée à une adénine désaminase [80 , 81]. Ces CBE et ABE génèrent des modifications ponctuelles de CG en TA et de TA en CG (transition), respectivement, avec de grandes fidélité et efficacité, y compris dans des modèles in vivo de DRH [82-83-84-85]. Ainsi, leurs avantages principaux résident dans l'absence d'une coupure double brin (pas besoin de NHEJ, source d'indels, ou d'HDR).
Cependant, l'approche de base editing ne permet que des transitions de CG en TA et vice versa, et est dépendante de la présence d'une séquence PAM en aval. De façon intéressante, toutefois, une étude de cohorte portant sur 12369 allèles a identifié que 53 % des variants pathogènes dans les principaux gènes des DRH ( ABCA4 , CEP290 , USH2A , MYO7A , EYS ) seraient théoriquement corrigeables par base editing [86]. Ainsi, même si, à ce jour, il n'existe pas d'essai thérapeutique appliquant le base editing dans les DRH chez l'humain, cette technique prometteuse pourrait se développer dans les prochaines années.
Prime editing ou édition par amorçage
L'édition prime, ou prime editing , constitue un des derniers développements de l'édition du génome (fig. 45-5
Fig. 45-5Schéma d'assemblage de la machinerie nécessaire au prime editing. La Cas9 nickase est guidée par le l'ARN guide de prime editing (prime editing guide RNA) (pegRNA) vers le locus cible (1), puis incise seulement le brin opposé au site PAM (protospacer adjacent motif) (2). Cette incision libère une extrémité 3′ simple brin qui servira d'amorce. Le brin d'ADN coupé s'hybride ensuite avec le séquence de fixation de l'amorce (SFA) du pegRNA. La transcriptase inverse (TI) fusionnée à la Cas9 utilise l'extrémité 3′ hybridée comme amorce, copie la matrice TI contenue dans le pegRNA et produit un fragment 3′ contenant la modification génomique voulue (3). Le génome contient alors deux versions locales : un fragment 5′ (ADN original) (4) et un fragment 3′ (ADN modifié) (3). Les voies endogènes de réparation du brin simple remplacent préférentiellement le fragment 5′ par le fragment 3′ modifié avec pour résultat un brin d'ADN contenant la modification cible (5).
Source : dessin de Cyrille Martinet.
). Un peu plus complexe que le base editing , elle repose sur une réparation médiée par une transcriptase inverse ( reverse transcriptase [RT]), ce qui élargit le répertoire des corrections mutationnelles possibles, incluant les délétions, les insertions et tous les types de transitions (A>G ou C>T) et de transversions (purine<=>pyrimidine, c'est-à-dire A<=>C, A<=>T, G<=>C ou G<=>T).
Tout comme le base editing , l'édition prime ne nécessite ni réparation de l'ADN dépendante de l'HDR, ni formation de cassures double brin activant les voies de réparation classiques de type NHEJ, source d'indels aléatoires. Elle implique une version modifiée de la Cas9, une Cas9 nickase (Cas9 avec H840A) qui ne coupe que l'un des doubles brin d'ADN, un ARN guide de prime editing ou prime editing guide RNA (pegRNA), constitué d'une séquence guide de 20 nucléotides qui guide la Cas9 sur le brin d'ADN, une séquence de fixation de l'amorce (SFA) qui s'hybride à l'ADN exposé, une matrice pour la transcriptase inverse (TI) qui contient la séquence de la modification souhaitée; et, enfin, une transcriptase inverse couplée à la Cas9 pour synthétiser le brin d'ADN complémentaire à partir du modèle codé dans l'ARN guide de prime editing (pegRNA).
Les différentes étapes de l'édition du génome par prime editing sont les suivantes : la Cas9 nickase est guidée par le pegRNA vers le locus cible (fig. 45-5
Fig. 45-5Schéma d'assemblage de la machinerie nécessaire au prime editing. La Cas9 nickase est guidée par le l'ARN guide de prime editing (prime editing guide RNA) (pegRNA) vers le locus cible (1), puis incise seulement le brin opposé au site PAM (protospacer adjacent motif) (2). Cette incision libère une extrémité 3′ simple brin qui servira d'amorce. Le brin d'ADN coupé s'hybride ensuite avec le séquence de fixation de l'amorce (SFA) du pegRNA. La transcriptase inverse (TI) fusionnée à la Cas9 utilise l'extrémité 3′ hybridée comme amorce, copie la matrice TI contenue dans le pegRNA et produit un fragment 3′ contenant la modification génomique voulue (3). Le génome contient alors deux versions locales : un fragment 5′ (ADN original) (4) et un fragment 3′ (ADN modifié) (3). Les voies endogènes de réparation du brin simple remplacent préférentiellement le fragment 5′ par le fragment 3′ modifié avec pour résultat un brin d'ADN contenant la modification cible (5).
Source : dessin de Cyrille Martinet.
, 1), puis elle incise seulement le brin opposé au site PAM (fig. 45-5
Fig. 45-5Schéma d'assemblage de la machinerie nécessaire au prime editing. La Cas9 nickase est guidée par le l'ARN guide de prime editing (prime editing guide RNA) (pegRNA) vers le locus cible (1), puis incise seulement le brin opposé au site PAM (protospacer adjacent motif) (2). Cette incision libère une extrémité 3′ simple brin qui servira d'amorce. Le brin d'ADN coupé s'hybride ensuite avec le séquence de fixation de l'amorce (SFA) du pegRNA. La transcriptase inverse (TI) fusionnée à la Cas9 utilise l'extrémité 3′ hybridée comme amorce, copie la matrice TI contenue dans le pegRNA et produit un fragment 3′ contenant la modification génomique voulue (3). Le génome contient alors deux versions locales : un fragment 5′ (ADN original) (4) et un fragment 3′ (ADN modifié) (3). Les voies endogènes de réparation du brin simple remplacent préférentiellement le fragment 5′ par le fragment 3′ modifié avec pour résultat un brin d'ADN contenant la modification cible (5).
Source : dessin de Cyrille Martinet.
, 2). Cette incision expose une extrémité 3′ simple brin qui servira d'amorce. Le brin d'ADN coupé s'hybride ensuite avec la SFA présent sur le pegRNA. Cela positionne exactement l'extrémité 3′ pour permettre la copie. La transcriptase inverse (TI) fusionnée à la Cas9 utilise l'extrémité 3′ hybridée comme amorce, copie la matrice de transcriptase inverse (MTI) contenue dans le pegRNA et produit un fragment 3′ contenant la modification génomique voulue (fig. 45-5
Fig. 45-5Schéma d'assemblage de la machinerie nécessaire au prime editing. La Cas9 nickase est guidée par le l'ARN guide de prime editing (prime editing guide RNA) (pegRNA) vers le locus cible (1), puis incise seulement le brin opposé au site PAM (protospacer adjacent motif) (2). Cette incision libère une extrémité 3′ simple brin qui servira d'amorce. Le brin d'ADN coupé s'hybride ensuite avec le séquence de fixation de l'amorce (SFA) du pegRNA. La transcriptase inverse (TI) fusionnée à la Cas9 utilise l'extrémité 3′ hybridée comme amorce, copie la matrice TI contenue dans le pegRNA et produit un fragment 3′ contenant la modification génomique voulue (3). Le génome contient alors deux versions locales : un fragment 5′ (ADN original) (4) et un fragment 3′ (ADN modifié) (3). Les voies endogènes de réparation du brin simple remplacent préférentiellement le fragment 5′ par le fragment 3′ modifié avec pour résultat un brin d'ADN contenant la modification cible (5).
Source : dessin de Cyrille Martinet.
, 3). Le génome contient alors deux versions locales : un fragment 5′ (ADN original) et un fragment 3′ (ADN modifié) (fig. 45-5
Fig. 45-5Schéma d'assemblage de la machinerie nécessaire au prime editing. La Cas9 nickase est guidée par le l'ARN guide de prime editing (prime editing guide RNA) (pegRNA) vers le locus cible (1), puis incise seulement le brin opposé au site PAM (protospacer adjacent motif) (2). Cette incision libère une extrémité 3′ simple brin qui servira d'amorce. Le brin d'ADN coupé s'hybride ensuite avec le séquence de fixation de l'amorce (SFA) du pegRNA. La transcriptase inverse (TI) fusionnée à la Cas9 utilise l'extrémité 3′ hybridée comme amorce, copie la matrice TI contenue dans le pegRNA et produit un fragment 3′ contenant la modification génomique voulue (3). Le génome contient alors deux versions locales : un fragment 5′ (ADN original) (4) et un fragment 3′ (ADN modifié) (3). Les voies endogènes de réparation du brin simple remplacent préférentiellement le fragment 5′ par le fragment 3′ modifié avec pour résultat un brin d'ADN contenant la modification cible (5).
Source : dessin de Cyrille Martinet.
, 4). Les voies endogènes de réparation du brin simple remplacent préférentiellement le fragment 5′ par le fragment 3′ modifié avec pour résultat un brin d'ADN contenant la modification cible ( fig. 45-5
Fig. 45-5Schéma d'assemblage de la machinerie nécessaire au prime editing. La Cas9 nickase est guidée par le l'ARN guide de prime editing (prime editing guide RNA) (pegRNA) vers le locus cible (1), puis incise seulement le brin opposé au site PAM (protospacer adjacent motif) (2). Cette incision libère une extrémité 3′ simple brin qui servira d'amorce. Le brin d'ADN coupé s'hybride ensuite avec le séquence de fixation de l'amorce (SFA) du pegRNA. La transcriptase inverse (TI) fusionnée à la Cas9 utilise l'extrémité 3′ hybridée comme amorce, copie la matrice TI contenue dans le pegRNA et produit un fragment 3′ contenant la modification génomique voulue (3). Le génome contient alors deux versions locales : un fragment 5′ (ADN original) (4) et un fragment 3′ (ADN modifié) (3). Les voies endogènes de réparation du brin simple remplacent préférentiellement le fragment 5′ par le fragment 3′ modifié avec pour résultat un brin d'ADN contenant la modification cible (5).
Source : dessin de Cyrille Martinet.
, 5).
Des preuves de concept thérapeutiques de la stratégie de prime editing ont été obtenues dans des modèles animaux de dystrophies rétiniennes, ouvrant la voie vers une application translationnelle humaine [ 87 , 88].
Tout comme les autres stratégies d'édition du génome, le prime editing présente quelques défis, notamment une efficacité variable selon le locus (structure de la chromatine, PBS optimal, matrice RT), la conception plus complexe du pegRNA (longueur du PBS, stabilité, structure secondaire) et la taille du système qui peut dépasser la capacité d'empaquetage des AAV et nécessiter l'emploi d'un système à deux vecteurs AAV, ou l'utilisation d'autres virus tels que les lentivirus.
Les différentes stratégies d'édition du génome actuelles.
Technologie
Mécanisme
Types de mutations
Limites
CRISPR/Cas9
Coupure DSB + NHEJ/HDR
Insertion/délétion ou knock-out allèle-spécifique
Effets off-target PAM Largeur des outils
Base editing (ABE/CBE)
Conversion C→T/A→G
Transitions
Uniquement transition
Prime editing
Cas9 nickase + TI via pegRNA
Transitions, transversions, petits indels
Design du pegRNA complexe Largeur des outils
ABE : adenine base editors (éditeurs de bases adénine); CBE : cytosine base editors (éditeurs de bases cytosine); CRISPR : clustered regularly interspaced short palindromic repeats; DSB : doublestrand break (cassure du double brin); HDR : homology-directed repair; NHEJ : non-homologous end joining; PAM : protospacer adjacent motif); pegRNA : prime editing guide RNA; TI : transcriptase inverse.
récapitule les différentes stratégies d'édition du génome actuelles.
Conclusion
Après l'avènement de l'analyse génomique comme outil puissant d'identification des défauts génétiques, les approches d'édition du génome marquent l'entrée dans une ère de médecine génomique de précision pour les dystrophies rétiniennes héréditaires, avec une translation clinique désormais tangible.
IV. Oligonucléotides antisens dans les maladies génétiques ophtalmologiques
J.-M. Rozet
Introduction
Les maladies génétiques ophtalmologiques, par leur complexité et leur diversité, représentent un défi majeur pour la recherche biomédicale et le développement de traitements efficaces. Ces affections, souvent rares, sont généralement causées par des variants génétiques spécifiques qui perturbent le développement, la fonction ou la structure des tissus oculaires. Bien que des progrès aient été réalisés dans le domaine des thérapies géniques, une approche plus ciblée et flexible, comme les oligonucléotides antisens ( antisens oligonucleotides [ASO]), offre de nouvelles perspectives pour corriger ou moduler les effets délétères de ces variants.
Thérapie antisens : une alternative pour surmonter les limites des thérapies géniques traditionnelles
Pour comprendre l'intérêt croissant des thérapies antisens dans les maladies rares génétiques et en particulier ici ophtalmologiques, il est essentiel de rappeler certains principes de la génétique fondamentale et médicale, et d'examiner les limites actuelles de la thérapie génique, éclairant ainsi l'utilité des ASO en tant qu'outils complémentaires dans le traitement de ces pathologies.
Le gène, unité fonctionnelle de l'information génétique, comprend des séquences transcrites en ARN messagers, codant les protéines, ou en ARN non codants régulateurs (tRNA, miRNA, lncRNA, SnoRNA, etc.), ainsi que des séquences non transcrites (promoteurs, enhancers , etc.) situées à proximité ou à distance, qui contrôlent la transcription de l'ARN. Ce dernier produit par transcription du gène renferme, en plus du code génétique nécessaire à la synthèse d'ARN messagers (ARNm) ou régulateurs, les signaux de modifications post-transcriptionnelles garantissant la stabilité, l'adressage cellulaire et, pour les messagers, la traduction en protéine. Les séquences des gènes sont le plus souvent discontinues, organisées en exons (codants) et introns (non codants), ces derniers devant être excisés pour permettre l'épissage des exons et produire un ARN fonctionnel (fig. 45-6
Fig. 45-6De la transcription du gène à la traduction : maturation de l'ARN pré-messager en ARN messager (ARNm) et synthèse protéique. La figure illustre le parcours d'un gène jusqu'à la production d'une protéine. Après transcription de l'ADN, le pré-ARNm contient des exons et des introns. L'épissage élimine les introns pour produire un ARNm mature coiffé en 5′ (m7G cap) et polyadénylé en 3′. Ce processus est contrôlé par des séquences régulatrices : ESE (exonic splicing enhancer) et ISE (intronic splicing enhancer) favorisent l'inclusion d'un exon, tandis que ESS (exonic splicing silencer) et ISS (intronic splicing silencer) favorisent son exclusion. L'ARNm mature est ensuite exporté vers le cytoplasme, où il est traduit par les ribosomes en protéine. Dans un contexte physiologique normal, l'exon central (en bleu) peut être inclus ou sauté, générant différentes isoformes protéiques à partir du même gène grâce à l'épissage alternatif. L'encart présente une structure secondaire possible d'un ARNm. Certaines régions de la molécule forment des tiges double brin par appariement de bases complémentaires, tandis que d'autres adoptent des boucles non appariées. Ces boucles constituent des sites privilégiés pour la régulation de l'expression génique ou pour des interventions thérapeutiques ciblant l'épissage et la stabilité de l'ARN.
Source : J.-M. Rozet.
).
Des milliers de variants, localisés dans plusieurs centaines de gènes, ont été identifiés comme responsables de maladies génétiques rares ophtalmologiques. Ces variants altérant le code génétique affectent principalement les séquences codantes (exons), mais aussi les introns et, en particulier, les jonctions exon-intron. Cette perturbation des séquences des gènes produit des ARNm altérés menant à des protéines dysfonctionnelles, voire, dans un nombre non négligeable de cas, à des formes toxiques de protéines. De telles perturbations peuvent également résulter de variants dans des séquences régulatrices essentielles à la transcription ou au traitement des transcrits.
La reconnaissance des dystrophies rétiniennes d'origine génétique comme indications pour le diagnostic moléculaire par séquençage du génome dans le cadre du Plan France médecine génomique (PFMG; https://pfmg2025.fr/) devrait entraîner une augmentation exponentielle du nombre de variants identifiés, en particulier parmi les variants non codants qui étaient jusqu'à présent plus difficiles à identifier par les technologies dites de panels ou de séquençage exomique.
Les thérapies géniques utilisant des vecteurs adéno-associés ( adeno-associated viruses [AAV]) pour restaurer la fonction d'un gène défectueux en apportant une copie fonctionnelle du gène altéré chez le malade ont montré un potentiel considérable, comme le prouve l'approbation du Luxturna® pour traiter l'amaurose congénitale de Leber (ACL) liée au gène RPE65 [89]. Bien que prometteuses, ces approches présentent des limites qui freinent leur utilisation à grande échelle. Elles ne sont efficaces que dans le cas de variants entraînant une perte de fonction, et ne conviennent donc pas aux variants à effet dominant négatif. Dans ce cas, elles entraînent la production de protéines ou d'ARN toxiques [ 90], qu'il ne suffit pas de compenser : il faut les éliminer. Même si l'on peut théoriquement envisager qu'une thérapie d'augmentation génique – en augmentant la quantité de protéine normale – réduise l'effet toxique de la protéine mutante par un phénomène de dilution, cette stratégie reste incertaine, et la surexpression elle-même peut devenir délétère. Ces variants, parce qu'ils sont dominants, se transmettent verticalement, avec un risque de 50 % à chaque génération. Ils ne sont donc pas rares et représentent des cibles thérapeutiques majeures, appelant le développement de stratégies spécifiques pour neutraliser les effets toxiques qu'ils induisent.
De plus, les vecteurs AAV ont une capacité d'encapsidation limitée [91 , 92], ce qui empêche le transfert de gènes de grande taille. Or, ces derniers sont fréquemment impliqués dans les maladies génétiques, en partie parce que plus un gène est long, plus il est exposé au risque de variants. Parmi ces gènes figurent ABCA4 , CEP290 , USH2A et EYS , associés respectivement à la maladie de Stargardt, à l'amaurose congénitale de Leber type 10 (ACL10), au syndrome d'Usher de type 2A et à la rétinite pigmentaire liée à EYS – qui comptent parmi les principales causes de malvoyance sévère chez l'enfant et l'adulte [93].
Des approches alternatives visant à surmonter cette contrainte sont en cours d'étude, notamment l'utilisation de vecteurs de plus grande capacité dérivés des lentivirus et des adénovirus [91 , 94]. Bien qu'ils offrent des solutions pour transporter des gènes de grande taille, ces vecteurs posent des défis supplémentaires en termes de sécurité et de régulation, notamment en raison de leur forte immunogénicité [91 , 95]. À cet égard, les systèmes de délivrance non viraux représentent une alternative prometteuse pour le transport des acides nucléiques dans les troubles rétiniens héréditaires. Ces systèmes, qui incluent des nanoparticules lipidiques, des polymères synthétiques et des peptides cationiques, offrent des avantages en termes de biocompatibilité, de réduction de la réponse immunitaire et de flexibilité dans la taille des gènes transportés [92 , 96]. Toutefois, leur efficacité de transfection et la stabilité des acides nucléiques demeurent des défis majeurs à surmonter pour une application clinique à grande échelle. Une autre alternative, les thérapies split-AAV , consiste à fractionner la séquence codante d'un gène cible en deux ou trois segments, chacun étant introduit dans un AAV distinct et administré simultanément pour permettre la production d'une protéine fonctionnelle complète [95]. Bien que ces stratégies tirent parti de la faible immunogénicité des AAV, de leur capacité à infecter efficacement les cellules rétiniennes et de leur innocuité démontrée, elles comportent également des limites, telles que le risque de recombinaison incorrecte, l'inefficacité de la délivrance des fragments dans les mêmes cellules, ainsi que la nécessité d'effectuer des études de toxicité pour chaque construction AAV individuellement [ 92 , 95 , 97].
Les limites d'encapsidation des vecteurs AAV contraignent l'utilisation exclusive des séquences codantes, sans les éléments régulateurs endogènes. Pour garantir l'expression du gène de remplacement, celui-ci est placé sous le contrôle d'un promoteur fort, ce qui peut entraîner une surexpression forcée du gène thérapeutique. Cette surexpression peut avoir des effets délétères, notamment lorsque la protéine déficiente fait partie d'un complexe macromoléculaire dont la stœchiométrie doit être finement régulée, comme dans le cas de la surexpression de BBS1 [ 95 , 98]. Les effets hors cible peuvent être limités en choisissant un promoteur spécifique et un sérotype de vecteur viral adapté, assurant ainsi un tropisme sélectif pour les cellules cibles. Toutefois, ces stratégies restreignent également les modes d'administration disponibles.
La méthode d'administration des thérapies géniques AAV par injection sous-rétinienne constitue une procédure invasive et délicate, associée à des risques non négligeables. Elle nécessite généralement une anesthésie générale, une vitrectomie, une rétinotomie, ainsi qu'un décollement temporaire de la rétine centrale [ 99 , 100]. Bien que cette approche soit maîtrisée et ait démontré son efficacité, des complications telles qu'une inflammation, une hémorragie, une infection ou un décollement rétinien ne peuvent pas être exclues. Des améliorations sont toutefois à espérer grâce à l'assistance robotique, comme le suggère la première étude réalisée chez l'humain avec un dispositif robotisé, menée sous anesthésie locale [101]. Cependant, même avec cette avancée technologique, la méthode reste limitée au pôle postérieur de la rétine et ne peut être appliquée que lorsque l'épaisseur rétinienne est suffisante [ 100]. La voie intravitréenne a également été explorée, mais elle s'est révélée moins satisfaisante, induisant des inflammations intraoculaires, et elle est par ailleurs considérée comme plus immunogène que l'espace sous-rétinien [ 102].
Enfin, bien que les thérapies géniques utilisant les vecteurs AAV aient initialement été conçues comme des traitements uniques, leur durabilité peut s'avérer limitée, comme le montre le traitement des ACL liées à RPE65 (Luxturna®). Une revue systématique et méta-analyse a mis en évidence une amélioration significative mais partielle et transitoire de la fonction visuelle, avec une diminution du bénéfice clinique au fil du temps [103]. Plusieurs mécanismes ont été proposés pour expliquer cette perte progressive d'efficacité, notamment la dégénérescence continue des photorécepteurs, en particulier ceux déjà altérés au moment de l'injection [104-105-106]; une réponse immunitaire locale limitant la durée d'expression du transgène; ainsi que le silençage épigénétique des promoteurs viraux [ 103].
Ces défis soulignent la nécessité de développer des approches complémentaires, telles que des stratégies de thérapie combinée (par exemple pharmacologique et génique), l'amélioration des vecteurs, et des traitements visant à cibler les variants produisant des produits toxiques. Bien que les thérapies géniques AAV aient démontré une grande pertinence et un impact significatif dans le traitement de maladies génétiques rares ophtalmologiques, il est important de reconnaître que ces traitements, tout en étant très prometteurs, ne sont pas exempts de limitations. La recherche continue dans ce domaine est essentielle pour surmonter ces défis et offrir des traitements encore plus efficaces et accessibles à un plus grand nombre de patients.
Les oligonucléotides antisens (ASO) émergent comme une option particulièrement prometteuse dans les stratégies visant à corriger des variants génétiques aux effets variés dans diverses pathologies, notamment les maladies rétiniennes [ 107]. Ils présentent l'avantage de surmonter la plupart des limites associées aux thérapies géniques utilisant des vecteurs AAV, constituant ainsi un complément précieux pour les patients ne pouvant pas bénéficier de ces traitements en raison des contraintes inhérentes à ces thérapies.
Un traitement des pertes et des gains de fonction pathologiques sans modification du génome
Les thérapies antisens à base d'oligonucléotides constituent une approche innovante de la thérapie par ARN, distincte d'autres stratégies comme celles impliquant les microARN (miARN) par leur mécanisme d'action hautement spécifique et ciblé [99-100-101]. Les ASO sont de courtes molécules synthétiques d'ADN ou d'ARN, d'environ 15 à 30 nucléotides, qui exploitent la complémentarité de séquence pour interagir de façon précise avec des régions cibles (fig. 45-7
Fig. 45-7Mécanismes d'action des oligonucléotides antisens (ASO). La figure illustre les différentes étapes du cycle de l'ARNm où des ASO (représentés par des peignes rouges) peuvent agir pour moduler l'expression génique. 1. Moduler le capping : les ASO peuvent interférer avec la mise en place de la coiffe 5′ (m7G cap), affectant la stabilité et la traduction de l'ARNm. 2. Moduler la polyadénylation : les ASO peuvent cibler les signaux de polyadénylation en 3′, modifiant la stabilité de l'ARNm. 3. Dégrader l'ARNm : en se fixant sur l'ARNm, certains ASO peuvent permettre le recrutement de la RNase Het induire la dégradation de l'ARNm ciblé, réduisant l'expression protéique. 4-5. Moduler l'épissage : les ASO se fixent sur des séquences régulatrices d'épissage (ESE, ISE, ESS, ISS) pour empêcher ou favoriser la reconnaissance d'un exon. Cela peut conduire à son exclusion ou son inclusion, et donc à la production d'isoformes protéiques différentes à partir du même gène. 6. Inhiber la traduction : les ASO peuvent bloquer la progression du ribosome le long de l'ARNm, empêchant la synthèse de la protéine. Ainsi, les ASO constituent des outils puissants pour moduler la maturation, la stabilité et la traduction des ARNm, permettant de corriger ou d'inhiber l'expression de gènes dans un contexte thérapeutique.
Source : J.-M. Rozet.
). En se liant aux éléments régulateurs de l'épissage, ils masquent les signaux nécessaires au splicéosome et modulent ainsi le traitement du pré-ARNm, favorisant l'exclusion ou, au contraire, l'inclusion ciblée de segments d'ARN (fig. 45-7
Fig. 45-7Mécanismes d'action des oligonucléotides antisens (ASO). La figure illustre les différentes étapes du cycle de l'ARNm où des ASO (représentés par des peignes rouges) peuvent agir pour moduler l'expression génique. 1. Moduler le capping : les ASO peuvent interférer avec la mise en place de la coiffe 5′ (m7G cap), affectant la stabilité et la traduction de l'ARNm. 2. Moduler la polyadénylation : les ASO peuvent cibler les signaux de polyadénylation en 3′, modifiant la stabilité de l'ARNm. 3. Dégrader l'ARNm : en se fixant sur l'ARNm, certains ASO peuvent permettre le recrutement de la RNase Het induire la dégradation de l'ARNm ciblé, réduisant l'expression protéique. 4-5. Moduler l'épissage : les ASO se fixent sur des séquences régulatrices d'épissage (ESE, ISE, ESS, ISS) pour empêcher ou favoriser la reconnaissance d'un exon. Cela peut conduire à son exclusion ou son inclusion, et donc à la production d'isoformes protéiques différentes à partir du même gène. 6. Inhiber la traduction : les ASO peuvent bloquer la progression du ribosome le long de l'ARNm, empêchant la synthèse de la protéine. Ainsi, les ASO constituent des outils puissants pour moduler la maturation, la stabilité et la traduction des ARNm, permettant de corriger ou d'inhiber l'expression de gènes dans un contexte thérapeutique.
Fig. 45-8Modulation de l'épissage par les oligonucléotides antisens (ASO) pour corriger des variants génétiques. 1. Redirection de l'épissage. Certains variants (*) peuvent induire un ou plusieurs événements d'épissage anormal (rouge). Les ASO (peignes verts) peuvent réorienter l'épissage de l'ARN pré-messager vers les sites consensus (bleu) en se fixant sur des séquences exoniques ou introniques, qu'elles soient activatrices ou inhibitrices de l'épissage. 1.1. Un variant affectant un site consensus d'épissage à la jonction exon-intron peut rediriger l'épissage vers : a) un site consensus alternatif situé dans l'intron suivant, conduisant à un saut d'exon; b, c) des sites cryptiques normalement silencieux (rectangles en pointillé vert), localisés soit dans les exons (perte partielle de l'exon, b), soit dans les introns (rétention partielle de l'intron, c). En bloquant des séquences inhibitrices de l'épissage (ESS ou ISS), les ASO permettent de rétablir l'utilisation correcte des sites consensus. 1.2. Un variant exonique faux-sens (substitution d'un acide aminé par un autre) ou silencieuse (sans modification de la séquence protéique) peut également perturber l'épissage. Ces variants sont susceptibles d'induire un saut d'exon complet (a) ou partiel (b). En se fixant sur la séquence mutée, un ASO peut corriger ce défaut et rétablir un ARNm normal. 1.3. Un variant intronique profond peut créer et/ou activer des sites cryptiques d'épissage, entraînant l'insertion d'un pseudo-exon dans l'ARNm. En ciblant la séquence mutée ou les signaux régulateurs voisins, un ASO peut empêcher ce défaut et restaurer un ARNm correct. 2. Saut d'exon. Les variants introduisant un codon stop prématuré peuvent être contournés par l'induction d'un saut d'exon, à condition que ce saut conserve le cadre de lecture. En bloquant la reconnaissance de l'exon contenant le variant (codon stop prématuré, représenté en rouge), les ASO favorisent son exclusion de l'ARNm, permettant la synthèse d'une protéine tronquée mais fonctionnelle. 3. TANGO (targeted augmentation of nuclear gene output). De nombreux gènes subissent un épissage alternatif qui génère plusieurs isoformes protéiques à partir d'un même ARN pré-messager. Les ASO peuvent moduler cet épissage en bloquant sélectivement certains sites, favorisant ainsi la production d'isoformes spécifiques.
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). En masquant des sites activateurs d'épissage ( exonic/intronic splicing enhancers [ESE/ISE]), les ASO peuvent induire un saut d'exon – c'est-à-dire l'exclusion spécifique d'un exon, seul ou en association avec d'autres exons, pour préserver le cadre de lecture. Ces ASO permettent de neutraliser les variants décalants et/ou les codons stop prématurés. Ils peuvent également masquer des sites cryptiques d'épissage (exonique ou intronique) afin de rediriger l'épissage vers les jonctions canoniques. La redirection d'épissage ( splice switching ) corrige les variants créant ou renforçant ces sites cryptiques, dont la reconnaissance par le splicéosome peut provoquer un saut partiel d'exon, un allongement d'exon par rétention intronique, ou la création d'un pseudo-exon selon leur localisation (voir fig. 45-8
Fig. 45-8Modulation de l'épissage par les oligonucléotides antisens (ASO) pour corriger des variants génétiques. 1. Redirection de l'épissage. Certains variants (*) peuvent induire un ou plusieurs événements d'épissage anormal (rouge). Les ASO (peignes verts) peuvent réorienter l'épissage de l'ARN pré-messager vers les sites consensus (bleu) en se fixant sur des séquences exoniques ou introniques, qu'elles soient activatrices ou inhibitrices de l'épissage. 1.1. Un variant affectant un site consensus d'épissage à la jonction exon-intron peut rediriger l'épissage vers : a) un site consensus alternatif situé dans l'intron suivant, conduisant à un saut d'exon; b, c) des sites cryptiques normalement silencieux (rectangles en pointillé vert), localisés soit dans les exons (perte partielle de l'exon, b), soit dans les introns (rétention partielle de l'intron, c). En bloquant des séquences inhibitrices de l'épissage (ESS ou ISS), les ASO permettent de rétablir l'utilisation correcte des sites consensus. 1.2. Un variant exonique faux-sens (substitution d'un acide aminé par un autre) ou silencieuse (sans modification de la séquence protéique) peut également perturber l'épissage. Ces variants sont susceptibles d'induire un saut d'exon complet (a) ou partiel (b). En se fixant sur la séquence mutée, un ASO peut corriger ce défaut et rétablir un ARNm normal. 1.3. Un variant intronique profond peut créer et/ou activer des sites cryptiques d'épissage, entraînant l'insertion d'un pseudo-exon dans l'ARNm. En ciblant la séquence mutée ou les signaux régulateurs voisins, un ASO peut empêcher ce défaut et restaurer un ARNm correct. 2. Saut d'exon. Les variants introduisant un codon stop prématuré peuvent être contournés par l'induction d'un saut d'exon, à condition que ce saut conserve le cadre de lecture. En bloquant la reconnaissance de l'exon contenant le variant (codon stop prématuré, représenté en rouge), les ASO favorisent son exclusion de l'ARNm, permettant la synthèse d'une protéine tronquée mais fonctionnelle. 3. TANGO (targeted augmentation of nuclear gene output). De nombreux gènes subissent un épissage alternatif qui génère plusieurs isoformes protéiques à partir d'un même ARN pré-messager. Les ASO peuvent moduler cet épissage en bloquant sélectivement certains sites, favorisant ainsi la production d'isoformes spécifiques.
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).
À l'inverse, en masquant des sites répresseurs d'épissage ( exonic/intronic splicing silencers [ESS/ISS]), les ASO peuvent favoriser l'inclusion d'un segment d'ARN dans le messager mature. Cette approche peut être utilisée pour neutraliser les variants provoquant l'exclusion totale ou partielle d'un exon, qu'il s'agisse principalement de variants des sites consensus aux jonctions intron-exon, ou de variants exoniques, en particulier silencieux, qui perturbent néanmoins l'épissage (par exemple progéria) (voir fig. 45-8
Fig. 45-8Modulation de l'épissage par les oligonucléotides antisens (ASO) pour corriger des variants génétiques. 1. Redirection de l'épissage. Certains variants (*) peuvent induire un ou plusieurs événements d'épissage anormal (rouge). Les ASO (peignes verts) peuvent réorienter l'épissage de l'ARN pré-messager vers les sites consensus (bleu) en se fixant sur des séquences exoniques ou introniques, qu'elles soient activatrices ou inhibitrices de l'épissage. 1.1. Un variant affectant un site consensus d'épissage à la jonction exon-intron peut rediriger l'épissage vers : a) un site consensus alternatif situé dans l'intron suivant, conduisant à un saut d'exon; b, c) des sites cryptiques normalement silencieux (rectangles en pointillé vert), localisés soit dans les exons (perte partielle de l'exon, b), soit dans les introns (rétention partielle de l'intron, c). En bloquant des séquences inhibitrices de l'épissage (ESS ou ISS), les ASO permettent de rétablir l'utilisation correcte des sites consensus. 1.2. Un variant exonique faux-sens (substitution d'un acide aminé par un autre) ou silencieuse (sans modification de la séquence protéique) peut également perturber l'épissage. Ces variants sont susceptibles d'induire un saut d'exon complet (a) ou partiel (b). En se fixant sur la séquence mutée, un ASO peut corriger ce défaut et rétablir un ARNm normal. 1.3. Un variant intronique profond peut créer et/ou activer des sites cryptiques d'épissage, entraînant l'insertion d'un pseudo-exon dans l'ARNm. En ciblant la séquence mutée ou les signaux régulateurs voisins, un ASO peut empêcher ce défaut et restaurer un ARNm correct. 2. Saut d'exon. Les variants introduisant un codon stop prématuré peuvent être contournés par l'induction d'un saut d'exon, à condition que ce saut conserve le cadre de lecture. En bloquant la reconnaissance de l'exon contenant le variant (codon stop prématuré, représenté en rouge), les ASO favorisent son exclusion de l'ARNm, permettant la synthèse d'une protéine tronquée mais fonctionnelle. 3. TANGO (targeted augmentation of nuclear gene output). De nombreux gènes subissent un épissage alternatif qui génère plusieurs isoformes protéiques à partir d'un même ARN pré-messager. Les ASO peuvent moduler cet épissage en bloquant sélectivement certains sites, favorisant ainsi la production d'isoformes spécifiques.
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).
Dans les maladies dominantes ou liées à une haplo-insuffisance, où un allèle sain coexiste avec un allèle muté, masquer les ISS/ESS sur l'exon sain présente également un intérêt pour renforcer l'expression de l'allèle fonctionnel. Cette stratégie, connue sous le nom de TANGO ( targeted augmentation of nuclear gene output ) , favorise l'inclusion de l'exon utile, et augmente la production d'ARNm et de protéine issus de l'allèle non muté (voir fig. 45-8
Fig. 45-8Modulation de l'épissage par les oligonucléotides antisens (ASO) pour corriger des variants génétiques. 1. Redirection de l'épissage. Certains variants (*) peuvent induire un ou plusieurs événements d'épissage anormal (rouge). Les ASO (peignes verts) peuvent réorienter l'épissage de l'ARN pré-messager vers les sites consensus (bleu) en se fixant sur des séquences exoniques ou introniques, qu'elles soient activatrices ou inhibitrices de l'épissage. 1.1. Un variant affectant un site consensus d'épissage à la jonction exon-intron peut rediriger l'épissage vers : a) un site consensus alternatif situé dans l'intron suivant, conduisant à un saut d'exon; b, c) des sites cryptiques normalement silencieux (rectangles en pointillé vert), localisés soit dans les exons (perte partielle de l'exon, b), soit dans les introns (rétention partielle de l'intron, c). En bloquant des séquences inhibitrices de l'épissage (ESS ou ISS), les ASO permettent de rétablir l'utilisation correcte des sites consensus. 1.2. Un variant exonique faux-sens (substitution d'un acide aminé par un autre) ou silencieuse (sans modification de la séquence protéique) peut également perturber l'épissage. Ces variants sont susceptibles d'induire un saut d'exon complet (a) ou partiel (b). En se fixant sur la séquence mutée, un ASO peut corriger ce défaut et rétablir un ARNm normal. 1.3. Un variant intronique profond peut créer et/ou activer des sites cryptiques d'épissage, entraînant l'insertion d'un pseudo-exon dans l'ARNm. En ciblant la séquence mutée ou les signaux régulateurs voisins, un ASO peut empêcher ce défaut et restaurer un ARNm correct. 2. Saut d'exon. Les variants introduisant un codon stop prématuré peuvent être contournés par l'induction d'un saut d'exon, à condition que ce saut conserve le cadre de lecture. En bloquant la reconnaissance de l'exon contenant le variant (codon stop prématuré, représenté en rouge), les ASO favorisent son exclusion de l'ARNm, permettant la synthèse d'une protéine tronquée mais fonctionnelle. 3. TANGO (targeted augmentation of nuclear gene output). De nombreux gènes subissent un épissage alternatif qui génère plusieurs isoformes protéiques à partir d'un même ARN pré-messager. Les ASO peuvent moduler cet épissage en bloquant sélectivement certains sites, favorisant ainsi la production d'isoformes spécifiques.
En plus de moduler l'épissage, les ASO peuvent influencer les modifications post-transcriptionnelles des régions non traduites 5′ et 3′ ( untranslated region [UTR]), ajustant ainsi la stabilité, la localisation ou la traduction des transcrits. Ils peuvent également interférer avec les signaux de régulation translationnelle, modulant son efficacité ou l'inhibant complètement (voir fig. 45-7
Fig. 45-7Mécanismes d'action des oligonucléotides antisens (ASO). La figure illustre les différentes étapes du cycle de l'ARNm où des ASO (représentés par des peignes rouges) peuvent agir pour moduler l'expression génique. 1. Moduler le capping : les ASO peuvent interférer avec la mise en place de la coiffe 5′ (m7G cap), affectant la stabilité et la traduction de l'ARNm. 2. Moduler la polyadénylation : les ASO peuvent cibler les signaux de polyadénylation en 3′, modifiant la stabilité de l'ARNm. 3. Dégrader l'ARNm : en se fixant sur l'ARNm, certains ASO peuvent permettre le recrutement de la RNase Het induire la dégradation de l'ARNm ciblé, réduisant l'expression protéique. 4-5. Moduler l'épissage : les ASO se fixent sur des séquences régulatrices d'épissage (ESE, ISE, ESS, ISS) pour empêcher ou favoriser la reconnaissance d'un exon. Cela peut conduire à son exclusion ou son inclusion, et donc à la production d'isoformes protéiques différentes à partir du même gène. 6. Inhiber la traduction : les ASO peuvent bloquer la progression du ribosome le long de l'ARNm, empêchant la synthèse de la protéine. Ainsi, les ASO constituent des outils puissants pour moduler la maturation, la stabilité et la traduction des ARNm, permettant de corriger ou d'inhiber l'expression de gènes dans un contexte thérapeutique.
Enfin, certains ASO recrutent des nucléases comme la RNase H pour dégrader des transcrits toxiques et atténuer ainsi les effets de variants [110] (voir fig. 45-7
Fig. 45-7Mécanismes d'action des oligonucléotides antisens (ASO). La figure illustre les différentes étapes du cycle de l'ARNm où des ASO (représentés par des peignes rouges) peuvent agir pour moduler l'expression génique. 1. Moduler le capping : les ASO peuvent interférer avec la mise en place de la coiffe 5′ (m7G cap), affectant la stabilité et la traduction de l'ARNm. 2. Moduler la polyadénylation : les ASO peuvent cibler les signaux de polyadénylation en 3′, modifiant la stabilité de l'ARNm. 3. Dégrader l'ARNm : en se fixant sur l'ARNm, certains ASO peuvent permettre le recrutement de la RNase Het induire la dégradation de l'ARNm ciblé, réduisant l'expression protéique. 4-5. Moduler l'épissage : les ASO se fixent sur des séquences régulatrices d'épissage (ESE, ISE, ESS, ISS) pour empêcher ou favoriser la reconnaissance d'un exon. Cela peut conduire à son exclusion ou son inclusion, et donc à la production d'isoformes protéiques différentes à partir du même gène. 6. Inhiber la traduction : les ASO peuvent bloquer la progression du ribosome le long de l'ARNm, empêchant la synthèse de la protéine. Ainsi, les ASO constituent des outils puissants pour moduler la maturation, la stabilité et la traduction des ARNm, permettant de corriger ou d'inhiber l'expression de gènes dans un contexte thérapeutique.
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). Grâce à cette polyvalence, les ASO offrent une spécificité et une adaptabilité remarquables pour le traitement d'un large éventail de maladies génétiques.
Cette diversité des modes d'action distingue nettement les ASO des autres approches de thérapie génique. Leur capacité à cibler spécifiquement les ARN permet d'intervenir à différents niveaux de la régulation post-transcriptionnelle tout en préservant l'intégrité du génome, offrant ainsi un potentiel unique et non permanent pour traiter un large spectre de maladies génétiques.
Entre modélisation et empirisme : une conception rationnelle appuyée par une chimie versatile au service des thérapies antisens
La complémentarité des ASO est essentielle à leur efficacité thérapeutique. Celle-ci permet un appariement spécifique aux séquences cibles d'ARN ou d'ADN, tout en limitant les effets hors cible. Au-delà de la simple reconnaissance de séquence, leur conception repose sur des critères thermodynamiques rigoureux, sur la taille et la structure secondaire des ARN cibles – qui doivent présenter des régions accessibles pour permettre un appariement efficace (voir fig. 45-7
Fig. 45-7Mécanismes d'action des oligonucléotides antisens (ASO). La figure illustre les différentes étapes du cycle de l'ARNm où des ASO (représentés par des peignes rouges) peuvent agir pour moduler l'expression génique. 1. Moduler le capping : les ASO peuvent interférer avec la mise en place de la coiffe 5′ (m7G cap), affectant la stabilité et la traduction de l'ARNm. 2. Moduler la polyadénylation : les ASO peuvent cibler les signaux de polyadénylation en 3′, modifiant la stabilité de l'ARNm. 3. Dégrader l'ARNm : en se fixant sur l'ARNm, certains ASO peuvent permettre le recrutement de la RNase Het induire la dégradation de l'ARNm ciblé, réduisant l'expression protéique. 4-5. Moduler l'épissage : les ASO se fixent sur des séquences régulatrices d'épissage (ESE, ISE, ESS, ISS) pour empêcher ou favoriser la reconnaissance d'un exon. Cela peut conduire à son exclusion ou son inclusion, et donc à la production d'isoformes protéiques différentes à partir du même gène. 6. Inhiber la traduction : les ASO peuvent bloquer la progression du ribosome le long de l'ARNm, empêchant la synthèse de la protéine. Ainsi, les ASO constituent des outils puissants pour moduler la maturation, la stabilité et la traduction des ARNm, permettant de corriger ou d'inhiber l'expression de gènes dans un contexte thérapeutique.
Source : J.-M. Rozet.
) –, ainsi que sur les propriétés physicochimiques influencées par leur chimie. Celle-ci a été optimisée pour répondre aux différents objectifs thérapeutiques – inhibition d'ARN toxiques, modulation d'épissage ou blocage de sites de régulation – en améliorant la stabilité, l'affinité de liaison et la compatibilité biologique des ASO. Des modifications structurales, telles que les liaisons phosphorothioates (PS) ou les altérations du ribose (2′-O-méthyl, 2′-O-méthoxyéthyl [LNA]), augmentent leur résistance à la dégradation enzymatique, prolongent leur demi-vie et facilitent leur pénétration cellulaire. D'autres ajustements chimiques – comme le capping terminal, l'incorporation de bases modifiées ou la conjugaison à des peptides ou lipides – permettent d'améliorer leur spécificité, de limiter les effets hors cible et d'optimiser leur distribution après administration intraoculaire [ 108 , 112-113-114].
Les principes fondamentaux du design des ASO ont été établis dès les années 2000, et ont évolué avec l'identification des modifications chimiques et des stratégies de séquençage optimales, ainsi qu'avec la compréhension approfondie des mécanismes d'action et des défis moléculaires, conduisant aujourd'hui à des ASO cliniquement approuvés nécessitant une optimisation continue [115-116-117-118-119-120-121-122-123].
Plusieurs guides encadrent désormais le développement des ASO. Des recommandations pour l'évaluation in vitro de l'efficacité des oligonucléotides de saut d'exon dans un cadre N-of-1 ont été formulées, insistant sur l'importance de protocoles standardisés, de contrôles positifs et de modèles cellulaires pertinents. En raison de la complexité des structures ARN et de l'environnement cellulaire, une validation empirique reste indispensable pour identifier la position de liaison optimale, nécessitant par exemple des tests de « glissement» de séquence.
Cette approche a été complétée par des directives techniques couvrant la chimie des ASO, les procédés de fabrication, la formulation et la gestion des impuretés [124]. Parallèlement, les lignes directrices N1C VARIANT visent à rationaliser l'évaluation de l'éligibilité des variants pathogènes dans le cadre de traitements ultra-personnalisés, en s'appuyant notamment sur des outils prédictifs comme eSkip [125] pour optimiser la conception des ASO. Sous l'égide du Patient Identification Working Group (PIWG), ces recommandations définissent les critères de sélection des variants, priorisent les indications cibles et organisent l'identification des patients éligibles. Après une première focalisation sur les variants récessifs à perte de fonction accessibles au saut d'exon ou à la redirection d'épissage, le périmètre a été élargi aux variants à effet dominant négatif ou à gain de fonction, avec intégration des stratégies d'extinction génique (ASO, siRNA) et d'activation de l'allèle sain (TANGO) [ 126]. Ce cadre a été enrichi de ressources pratiques, incluant des études de cas, des supports vidéo et un outil interactif d'analyse des variants, le Variant Eligibility Calculator [127].
D'autres outils indépendants, tels que ASOptimizer (optimisation des séquences et modifications chimiques par deep learning [ 128]), openASO (plateforme de design d'ASO semi-automatisée [129]), ou PFRED (évaluation intégrée des critères de design des ASO, incluant off-targets , SNP et stabilité [ 130]), ont également été développés pour faciliter le design des ASO.
Ensemble, ces contributions traduisent une avancée vers une médecine de précision fondée sur des ASO individualisés, soutenue par une exigence de validation rigoureuse et par le partage interlaboratoires des données.
Un mode d'administration de routine en ophtalmologie, modérément invasif, sans adjuvant, ni vecteur
Le mode d'administration des ASO est essentiel pour prévenir leur dégradation, prolonger leur demi-vie et garantir leur pénétration dans les cellules cibles d'un tissu, où ils interagissent avec leurs cibles spécifiques, qu'il s'agisse d'ARN mature dans le cytoplasme, ou d'ADN ou de pré-ARN dans le noyau cellulaire. Afin de faciliter leur administration et leur absorption cellulaire, les ASO peuvent être conjugués à des transporteurs, des peptides ou des lipides, ce qui améliore leur biodisponibilité et leur efficacité in vivo [112 , 114]. Dans le cadre des applications rétiniennes, il a été démontré qu'une injection intravitréenne d'ASO nus, sans adjuvant, ni vecteur, formulée dans de l'eau ou un simple tampon salin, permet de cibler efficacement les ARN cytoplasmiques ainsi que les pré-ARN nucléaires dans toutes les couches rétiniennes, depuis les cellules ganglionnaires jusqu'à l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR), en passant par les photorécepteurs, du centre vers la périphérie [131]. Ainsi, en plus de l'avantage évident d'un composé sans adjuvant, facilitant les études précliniques de toxicité, ce mode d'administration présente également l'atout d'être rapide et réalisable en clinique ou en cabinet sous anesthésie locale, en fonction de l'âge et de l'acceptation du patient, avec un faible risque et peu de complications, hormis l'apparition de cataractes [132 , 133]. Le mode d'administration intravitréen constitue donc une alternative intéressante pour traiter à la fois les atteintes diffuses et centrales de la rétine [131 , 132 , 134 , 135], sans dépendre de la taille du gène cible, ni de l'état de la rétine, qui n'est pas affectée par le geste médical.
Avantages d'un effet non permanent mais durable
Les ASO offrent plusieurs avantages, mais comportent également des inconvénients notables. Contrairement aux thérapies géniques, qui peuvent traiter divers variants d'un gène causant une perte de fonction, les ASO ciblent spécifiquement une ou quelques variants. De plus, alors que la thérapie génique peut être administrée en une seule fois, même si cela comporte des risques et est limité au pôle postérieur d'une rétine relativement intacte, les traitements par ASO nécessitent des administrations répétées. La fréquence de ces traitements dépend principalement de la stabilité des ASO dans la rétine, des efforts considérables étant déployés pour améliorer leurs caractéristiques pharmacodynamiques, ainsi que de leur taux d'élimination [112 , 114]. Ce dernier est influencé par plusieurs facteurs, notamment la cible cellulaire et la cible nucléique elle-même [ 112 , 114]. En particulier, pour le traitement des cellules rétiniennes neurosensorielles post-mitotiques, cette caractéristique contribue à une demi-vie exceptionnellement longue des ASO à l'échelle cellulaire dans la rétine. Dans les modèles précliniques, une demi-vie rétinienne prolongée de l'ordre de 2 mois a été mesurée après injection intravitréenne d'ASO de seconde génération chez le singe [136], ce qui contribue à limiter la fréquence des administrations. À cela s'ajoute l'interaction entre l'ASO et sa cible nucléique, qui semble prolonger la persistance de l'oligonucléotide dans la rétine. En effet, une étude menée chez la souris a montré une élimination rapide des oligonucléotides « sens», sans cible, en une dizaine de jours seulement après l'injection intravitréenne. Les mêmes oligonucléotides en « antisens» étaient toujours décelables en fin d'étude, à 1 mois suivant l'injection [131]. Les oligonucléotides traversant toute la rétine, quelle que soit leur cible cellulaire, ces observations impliquent une exposition limitée des cellules qui n'expriment pas la cible nucléique, réduisant ainsi les risques d'effets indésirables [131].
Si la fréquence des traitements fondés sur l'interférence ARN, visant à détruire un ARN ou une protéine toxique, dépend largement de la stabilité des ASO et de leur taux d'élimination, d'autres facteurs viennent également influencer cette fréquence lorsque les ASO agissent sur un pré-ARN messager ou une région régulatrice de l'ADN pour produire une protéine fonctionnelle ou en augmenter l'expression. La demi-vie de la protéine générée joue un rôle déterminant, impactant directement la durée du bénéfice visuel et, par conséquent, l'intervalle nécessaire entre deux injections. Il est intéressant de noter que les protéines de grande taille, souvent issues de gènes volumineux et difficiles à encapsider dans les AAV, présentent généralement des demi-vies plus longues qui peuvent aller jusqu'à 2 mois [137].
Ainsi, la persistance de l'effet thérapeutique dépend d'une combinaison complexe, prenant en compte la demi-vie de l'ASO, sa cible, la protéine et le taux de renouvellement des cellules hôtes. Pour les ASO utilisés dans les maladies de la rétine touchant des cellules post-mitotiques, les traitements répétés sont en définitive peu fréquents (actuellement deux fois par an [138]). Cette approche offre l'avantage d'un effet durable, mais non permanent, ce qui limite les risques d'effets indésirables et permet un ajustement de la dose ou l'interruption du traitement en cas d'effets indésirables sévères, ce qui n'est pas possible dans le cadre de thérapies géniques utilisant des vecteurs viraux. Cela permettra aussi aux malades de bénéficier d'autres approches thérapeutiques potentielles en développement.
Thérapies antisens en cours en ophtalmogénétique
Les thérapies antisens destinées au traitement des maladies génétiques rares ophtalmologiques en cours ou en développement préclinique reposent principalement sur leur capacité à moduler l'épissage pour restaurer la fonction des gènes déficients, à recruter des nucléases pour éliminer les ARN mutants et atténuer leurs effets toxiques [ 139] (tableau 45-2
Tableau 45-2
Essais cliniques terminés ou en cours utilisant des oligonucléotides antisens (ASO).
Variants
Effet du variant
Transmission
Essai clinique
Phase
Promoteur
ASO
Type d'ASO
Type de thérapie ARN
Conception et objectifs
Intervention
Population
Statut
c.2991+1655A>G; p.Cys998*
Introduction d'un pseudo-exon entre les exons 26 et 27 codant un stop prématuré de la traduction
Autosomique récessive
PQ-110-001 (NCT03140969)
Ib/II
ProQR Therapeutics
Sepofarsen
2′-O-méthyl phosphorothioate (2′OMe PS)
Redirection de l'épissage
Étude ouverte, doses multiples pour évaluer l'efficacité, la sécurité, la tolérance et l'exposition systémique; suivi 24 mois
IVT dans un œil tous les 3 mois, jusqu'à 4 doses; jusqu'à 3 niveaux de dose
N = 11; ≥ 6 ans; ACL10 due à la variant CEP290 c.2991+1655A>G
Terminé
c.2991+1655A>G; p.Cys998*
Introduction d'un pseudo-exon entre les exons 26 et 27 codant un stop prématuré de la traduction
Autosomique récessive
INSIGHT EXTENSION/PQ-110-002 (NCT03913130)
Ib/II
ProQR Therapeutics
Sepofarsen
2′OMe PS
Redirection de l'épissage
Extension de PQ-110-001; évaluation de la sécurité et efficacité à long terme, suivi 24 mois
IVT dans l'œil précédemment traité + traitement de l'œil controlatéral; tous les 6 mois
N = 9; ≥ 6 ans; ACL10 due à la variant CEP290 c.2991+1655A>G
Terminé
c.2991+1655A>G; p.Cys998*
Introduction d'un pseudo-exon entre les exons 26 et 27 codant un stop prématuré de la traduction
Autosomique récessive
ILLUMINATE/PQ-110-003 (NCT03913143)
II/III
ProQR Therapeutics
Sepofarsen
2′OMe PS
Redirection de l'épissage
Étude randomisée, double aveugle, doses multiples; évaluation de l'efficacité, sécurité, tolérance; suivi 24 mois
IVT dans un œil; tous les 6 mois; deux niveaux de dose; crossover à l'œil controlatéral après 12 mois
N = 36; ≥ 8 ans; ACL10 due à la variant CEP290 c.2991+1655A>G
Terminé
c.2991+1655A>G; p.Cys998*
Introduction d'un pseudo-exon entre les exons 26 et 27 codant un stop prématuré de la traduction
Autosomique récessive
HYPERION (NCT06891443)
III
Sepul Bio (Thea)
Sepofarsen
2′OMe PS
Redirection de l'épissage
Essai multicentrique, double aveugle, comparatif œil traité versus œil non traité
IVT; calendrier à définir selon protocole
N = 32 patients ≥ 6 ans avec ACL10 due à CEP290c.2991 +1655A>G (6 ans et +) répartis en 2 groupes Sepofarsen versus placebo
Recrutement en cours
c.2991+1655A>G; p.Cys998*
Introduction d'un pseudo-exon entre les exons 26 et 27 codant un stop prématuré de la traduction
Autosomique récessive
BRIGHTEN (PQ-110-005; NCT04855045)
II/III
ProQR Therapeutics
Sepofarsen
2′OMe PS
Redirection de l'épissage
Essai ouvert avec escalade de dose, puis étude randomisée, contrôlée et en double aveugle évaluant la sécurité et la tolérabilité du sepofarsen chez les enfants < 8 ans; suivi 24 mois
IVT dans un œil, trois niveaux de dose
N = 15 patients < 8 ans avec ACL10 due à CEP290c.2991 +1655A>G
Terminé
c.2299delG; p.(Glu767Serfs*21); tout autre variant non-sens ou décalent dans l'exon 13
Décalage du cadre de lecture et apparition d'un codon stop prématuré de la traduction
Autosomique récessive
Stellar/PQ-421a-001 (NCT03780257)
Ib/II
ProQR Therapeutics
Ultevursen
2′MOE PS
Saut d'exon
Étude randomisée, masquée, escalade de dose; évaluation sécurité et tolérance; suivi 24 mois
IVT dans un œil, dose unique; trois niveaux de dose
N = 18; ≥ 18 ans; syndrome d'Usher dû à un variant de l'exon 13 d' USH2A
Terminé
c.2299delG; p.(Glu767Serfs*21); tout autre variant non-sens ou décalent dans l'exon 14
Décalage du cadre de lecture et apparition d'un codon stop prématuré de la traduction
Autosomique récessive
Helia extension/PQ-421a-002 (NCT05085964)
Ib/II
ProQR Therapeutics
Ultevursen
2′MOE PS
Saut d'exon
Extension de PQ-421a-001; suivi long terme sécurité et efficacité
IVT continue dans l'œil précédemment traité + œil controlatéral; tous les 6 mois
Jusqu'à 100 participants; ≥ 18 ans; syndrome d'Usher dû à un variant de l'exon 13 d' USH2A
Terminé
c.2299delG; p.(Glu767Serfs*21); tout autre variant non-sens ou décalent dans l'exon 15
Décalage du cadre de lecture et apparition d'un codon Stop prématuré de la traduction
Autosomique récessive
Sirius/PQ-421a-003 (NCT05158296)
II/III
ProQR Therapeutics
Ultevursen
2′MOE PS
Saut d'exon
Étude randomisée, double aveugle, doses multiples; évaluation efficacité, sécurité et tolérance; suivi 27 mois
IVT dans un œil, dose unique; deux niveaux de dose; crossover après 12 mois
N = 81; ≥ 12 ans; syndrome d'Usher dû à un variant de l'exon 13 d' USH2A
Terminé
c.68C>A; P23H
Repliement anormal, toxique, de la protéine
Autosomique dominante
Aurora/PQ-1123-001 (NCT04123626)
Ib/II
ProQR Therapeutics
QR-1123
Gapmer 2′- O-(2-méthoxyéthyl) (MOE)
Recrutement RNAseH - dégéradation d'ARNm mutant
Étude randomisée, ouverte ou masquée; escalade de dose; évaluation sécurité, tolérance et efficacité; suivi 12 mois
IVT dans un œil; dose unique ou répétée tous les 3 mois
N = 35; ≥ 18 ans; RP autosomique dominante due au variant P23H de RHO
Terminé
Variants dominants du gène OPA1
Haplo-insuffisance
Autosomique dominante
STK-002 (https://clinicaltrials.eu/inn/stk-002/)
I/II
Stoke Therapeutics
STK-002
Non communiqué
Augmentation de l'expression de l'ARNm productif
Étude multicentrique, escalade de dose; évaluation sécurité, tolérance et pharmacocinétique
IVT ou systémique selon protocole
N =?; ≥ 18 ans OPA1 haplo-insuffisante; variants dominants
Recrutement en cours
ACL : amaurose congénitale de Leber; IVT : injection intravitréenne; RP : rétinopathie pigmentaire.
). La modulation de l'expression génique par l'interférence avec des signaux impliqués dans la transcription et les modifications post-transcriptionnelle impliquées dans la stabilité, l'adressage ou la traduction des messagers ARN reste principalement à l'état de recherche, se concentrant pour l'instant sur la génération de modèles animaux.
Thérapies fondées sur la modulation de l'épissage
Plusieurs études ont montré que les ASO de synthèse peuvent se lier aux pré-ARNm et moduler directement l'épissage, tant in vitro qu'in vivo, en masquant des signaux amplificateurs ou répresseurs localisés dans les introns ou les exons.
Redirection de l'épissage : exemple du sepofarsen
L'utilisation des ASO constitue une approche thérapeutique prometteuse pour traiter les variants qui altèrent l'épissage de pré-messager ARN, notamment les variants introniques profonds, qui génèrent de nouveaux signaux d'épissage éloignés des jonctions exon-intron [140]. Ces variants entraînent la rétention partielle ou totale d'un intron dans l'ARN messager mature et, dans certains cas, transforment une portion de l'intron en pseudo-exon (voir fig. 45-8
Fig. 45-8Modulation de l'épissage par les oligonucléotides antisens (ASO) pour corriger des variants génétiques. 1. Redirection de l'épissage. Certains variants (*) peuvent induire un ou plusieurs événements d'épissage anormal (rouge). Les ASO (peignes verts) peuvent réorienter l'épissage de l'ARN pré-messager vers les sites consensus (bleu) en se fixant sur des séquences exoniques ou introniques, qu'elles soient activatrices ou inhibitrices de l'épissage. 1.1. Un variant affectant un site consensus d'épissage à la jonction exon-intron peut rediriger l'épissage vers : a) un site consensus alternatif situé dans l'intron suivant, conduisant à un saut d'exon; b, c) des sites cryptiques normalement silencieux (rectangles en pointillé vert), localisés soit dans les exons (perte partielle de l'exon, b), soit dans les introns (rétention partielle de l'intron, c). En bloquant des séquences inhibitrices de l'épissage (ESS ou ISS), les ASO permettent de rétablir l'utilisation correcte des sites consensus. 1.2. Un variant exonique faux-sens (substitution d'un acide aminé par un autre) ou silencieuse (sans modification de la séquence protéique) peut également perturber l'épissage. Ces variants sont susceptibles d'induire un saut d'exon complet (a) ou partiel (b). En se fixant sur la séquence mutée, un ASO peut corriger ce défaut et rétablir un ARNm normal. 1.3. Un variant intronique profond peut créer et/ou activer des sites cryptiques d'épissage, entraînant l'insertion d'un pseudo-exon dans l'ARNm. En ciblant la séquence mutée ou les signaux régulateurs voisins, un ASO peut empêcher ce défaut et restaurer un ARNm correct. 2. Saut d'exon. Les variants introduisant un codon stop prématuré peuvent être contournés par l'induction d'un saut d'exon, à condition que ce saut conserve le cadre de lecture. En bloquant la reconnaissance de l'exon contenant le variant (codon stop prématuré, représenté en rouge), les ASO favorisent son exclusion de l'ARNm, permettant la synthèse d'une protéine tronquée mais fonctionnelle. 3. TANGO (targeted augmentation of nuclear gene output). De nombreux gènes subissent un épissage alternatif qui génère plusieurs isoformes protéiques à partir d'un même ARN pré-messager. Les ASO peuvent moduler cet épissage en bloquant sélectivement certains sites, favorisant ainsi la production d'isoformes spécifiques.
Source : J.-M. Rozet.
). Ces modifications du code génétique introduisent, dans la majorité des cas, un codon d'arrêt prématuré de la traduction, provoquant une perte de fonction de la protéine. Ce phénomène est particulièrement accessible aux thérapies ASO qui ciblent les sites cryptiques d'épissage pour rediriger l'épissage vers des sites normaux, produisant ainsi un ARN messager conforme à la séquence génétique normale (voir fig. 45-8
Fig. 45-8Modulation de l'épissage par les oligonucléotides antisens (ASO) pour corriger des variants génétiques. 1. Redirection de l'épissage. Certains variants (*) peuvent induire un ou plusieurs événements d'épissage anormal (rouge). Les ASO (peignes verts) peuvent réorienter l'épissage de l'ARN pré-messager vers les sites consensus (bleu) en se fixant sur des séquences exoniques ou introniques, qu'elles soient activatrices ou inhibitrices de l'épissage. 1.1. Un variant affectant un site consensus d'épissage à la jonction exon-intron peut rediriger l'épissage vers : a) un site consensus alternatif situé dans l'intron suivant, conduisant à un saut d'exon; b, c) des sites cryptiques normalement silencieux (rectangles en pointillé vert), localisés soit dans les exons (perte partielle de l'exon, b), soit dans les introns (rétention partielle de l'intron, c). En bloquant des séquences inhibitrices de l'épissage (ESS ou ISS), les ASO permettent de rétablir l'utilisation correcte des sites consensus. 1.2. Un variant exonique faux-sens (substitution d'un acide aminé par un autre) ou silencieuse (sans modification de la séquence protéique) peut également perturber l'épissage. Ces variants sont susceptibles d'induire un saut d'exon complet (a) ou partiel (b). En se fixant sur la séquence mutée, un ASO peut corriger ce défaut et rétablir un ARNm normal. 1.3. Un variant intronique profond peut créer et/ou activer des sites cryptiques d'épissage, entraînant l'insertion d'un pseudo-exon dans l'ARNm. En ciblant la séquence mutée ou les signaux régulateurs voisins, un ASO peut empêcher ce défaut et restaurer un ARNm correct. 2. Saut d'exon. Les variants introduisant un codon stop prématuré peuvent être contournés par l'induction d'un saut d'exon, à condition que ce saut conserve le cadre de lecture. En bloquant la reconnaissance de l'exon contenant le variant (codon stop prématuré, représenté en rouge), les ASO favorisent son exclusion de l'ARNm, permettant la synthèse d'une protéine tronquée mais fonctionnelle. 3. TANGO (targeted augmentation of nuclear gene output). De nombreux gènes subissent un épissage alternatif qui génère plusieurs isoformes protéiques à partir d'un même ARN pré-messager. Les ASO peuvent moduler cet épissage en bloquant sélectivement certains sites, favorisant ainsi la production d'isoformes spécifiques.
Source : J.-M. Rozet.
). Le variant c.2991+1655A>G du gène CEP290 , qui active des sites cryptiques d'épissage en profondeur dans l'intron 26 et entraîne l'insertion d'un pseudo- exon de 128 nucléotides dans l'ARN messager [141], en offre un exemple emblématique (fig. 45-9
Fig. 45-9Thérapies par oligonucléotides antisens (ASO) en cours d'essai clinique. Pour chaque cible, sont représentés, de haut en bas : le gène et sa localisation chromosomique, l'ARN pré-messager (avec les sites consensus d'épissage aux jonctions intron-exon indiqués par des rectangles pleins et les sites cryptiques par des rectangles en pointillés, en bleu pour la situation normale et en rouge pour la situation pathologique), l'ARN messager et la protéine; et de droite à gauche la situation normale, pathologique (les variants sont symbolisés par une étoile rouge au niveau du gène et de son ARN pré-messager, et par un codon stop lorsqu'ils introduisent un codon de terminaison prématuré dans l'ARN messager) et l'effet attendu du traitement par ASO. Un seul allèle est représenté pour CEP290 et USH2A, dont les maladies associées sont de transmission autosomique récessive. En revanche, les deux allèles, normal et mutant, sont présentés pour RHO et OPA1, dont les variants sont responsables de maladies à transmission autosomique dominante. Dans le cas d'OPA1, le variant est représenté de façon arbitraire dans l'exon 5, mais l'approche TANGO vise des mécanismes d'épissage qui dépassent cet exon.
Source : J.-M. Rozet.
).
CEP290 (MIM 610142; Gene ID : 80184), situé sur le bras long du chromosome 12, est un gène de grande taille, s'étendant sur plus de 90000 nucléotides. Il comprend 54 exons séparés par 53 introns et est transcrit en un ARN messager de 7824 nucléotides. Ce dernier présente un cadre de lecture de 7437 nucléotides, codant pour une protéine centrosomale de 290 kDa qui lui a donné son nom ( CEP290 ) [142]. Cette protéine joue un rôle crucial dans la régulation du cycle cellulaire et intervient également lors de la transition vers la quiescence, facilitant la formation des cils primaires [143]. Ces structures qui ressemblent à des antennes sont présentes sur presque toutes les cellules des mammifères, y compris les photorécepteurs, et sont essentielles pour de nombreuses fonctions cellulaires [144]. Dans les photorécepteurs, le segment externe, un cil modifié, optimise la captation de la lumière et sa conversion en signaux neuronaux envoyés vers les aires corticales visuelles. CEP290 est localisé dans la zone de transition à la base du cil, ou cil connecteur, où il régule les échanges protéiques entre le corps cellulaire (le segment interne des photorécepteurs) et le compartiment ciliaire, constitué des segments internes et externes des photorécepteurs [145]. Ce rôle est essentiel pour assurer la biogenèse et le bon fonctionnement des structures ciliaires. Les variants de CEP290 perturbent ces processus, avec des manifestations variables selon l'importance des cils dans les tissus affectés. Dans des cellules hautement dépendantes des cils, comme les photorécepteurs, ces variants ont des conséquences dramatiques, responsables de l'ACL10 (MIM 611755) [141 , 146]. Cette forme représente la cause génétique la plus fréquente de cette maladie (environ 20 % de cas), qui comprend plus de 20 sous-types, et constitue la première cause de cécité incurable chez l'enfant (MIM 611755). La formation des segments externes des photorécepteurs est compromise par la perturbation de la formation des cils due aux variants de CEP290 , comme cela a été démontré dans des modèles murins [147-148-149-150] et confirmé dans des organoïdes rétiniens issus de cellules souches humaines [151]. Par ailleurs, une préservation partielle de la couche nucléaire externe (CNE) fovéale persistant parfois jusqu'à l'âge adulte a été découverte à l'OCT [152]. De manière intéressante, la stratification distale de cette couche reste indistincte, suggérant un défaut de formation ou de maintien des segments externes des photorécepteurs [152], ce qui concorde avec la perte précoce de sensibilité à la lumière, se manifestant par la cécité néonatale caractéristique des ACL. La raison pour laquelle les photorécepteurs dépourvus de segments externes ou ne possédant que des segments externes rudimentaires dégénèrent lentement reste inconnue. Une accumulation anormale de protéines dans les segments internes, notamment des protéines de la cascade de transduction visuelle, pourrait causer un stress cellulaire, notamment par l'activation de voies de stress oxydatif et apoptotique, contribuant ainsi à la dégénérescence progressive des photorécepteurs [149].
Les anomalies de la ciliogenèse liées aux variants de CEP290 ne se limitent pas à la rétine. Elles affectent également d'autres tissus, le plus souvent de manière silencieuse sur le plan clinique, mais parfois de façon sévère, causant des ciliopathies syndromiques telles que les syndromes de Joubert, de Senior-Løken et de Meckel [153-154-155]. Parmi les manifestations silencieuses, on compte notamment les défauts de formation des cils dans l'épithélium nasal [156] et les fibroblastes dérivés de la peau des patients [157-158-159]. Ces derniers représentent une opportunité précieuse comme modèle expérimental pour le développement de thérapies ciblées [ 157 , 159].
Bien que ces cellules n'expriment pas de phénotypes pathologiques visibles, elles reproduisent fidèlement les défauts moléculaires de la ciliogenèse, ce qui en fait des modèles pertinents pour les études précliniques [157-158-159]. La disponibilité de tels modèles, combinée avec la prévalence élevée du variant c.2991+1655A>G, principale cause d'ACL10 dans les populations d'Europe du Nord et de l'Ouest [ 141 , 146] et, par extension, dans les pays où ces populations se sont largement établies, fait de ce variant une cible particulièrement pertinente pour les études précliniques. Les contraintes techniques liées à la taille du gène CEP290 (incompatible avec les vecteurs AAV) et à la sévérité de la maladie, tout en laissant une fenêtre thérapeutique, renforcent l'intérêt de ce variant pour des approches innovantes fondées sur les ASO.
Ce variant a été sélectionné à la fois pour répondre à un besoin médical non satisfait, démontrer la faisabilité des thérapies antisens dans les dystrophies rétiniennes héréditaires et confirmer la pertinence des fibroblastes dérivés de patients comme modèle préclinique pour l'évaluation des thérapies ciblant les ciliopathies. Les travaux précliniques réalisés dans ces cellules ont permis de valider le concept de correction de l'épissage, de rétablissement de la production de la protéine CEP290 et d'amélioration de la ciliogenèse grâce à des ASO conçus pour bloquer les sites cryptiques d'épissage [157]. Cela a été complété par des études chez la souris, ayant démontré un ciblage efficace des pré-ARN messagers dans toutes les couches rétiniennes par administration intravitréenne d'ASO nus [131], ces travaux pionniers dans le domaine des maladies rares ophtalmologiques ont permis de poser les bases des futurs essais cliniques utilisant le QR-110 renommé sepofarsen.
Le sepofarsen est un oligonucléotide antisens simple brin de 17 bases, composé de ribonucléotides modifiés par des groupements 2′-O-méthyl et des liaisons phosphorothioates, ciblant le site accepteur cryptique activé par le variant c.2991+1655A>G (voir fig. 45-9
Fig. 45-9Thérapies par oligonucléotides antisens (ASO) en cours d'essai clinique. Pour chaque cible, sont représentés, de haut en bas : le gène et sa localisation chromosomique, l'ARN pré-messager (avec les sites consensus d'épissage aux jonctions intron-exon indiqués par des rectangles pleins et les sites cryptiques par des rectangles en pointillés, en bleu pour la situation normale et en rouge pour la situation pathologique), l'ARN messager et la protéine; et de droite à gauche la situation normale, pathologique (les variants sont symbolisés par une étoile rouge au niveau du gène et de son ARN pré-messager, et par un codon stop lorsqu'ils introduisent un codon de terminaison prématuré dans l'ARN messager) et l'effet attendu du traitement par ASO. Un seul allèle est représenté pour CEP290 et USH2A, dont les maladies associées sont de transmission autosomique récessive. En revanche, les deux allèles, normal et mutant, sont présentés pour RHO et OPA1, dont les variants sont responsables de maladies à transmission autosomique dominante. Dans le cas d'OPA1, le variant est représenté de façon arbitraire dans l'exon 5, mais l'approche TANGO vise des mécanismes d'épissage qui dépassent cet exon.
Source : J.-M. Rozet.
). Son efficacité moléculaire (redirection de l'épissage) a été confirmée in vivo chez la souris [160], mais aussi in vitro dans des fibroblastes et des organoïdes rétiniens dérivés de patients porteurs de ce variant [161], selon les critères moléculaires et fonctionnels établis lors des travaux initiaux. Sa biodisponibilité dans les cellules cibles, sa stabilité rétinienne (avec une demi-vie de 2 mois) et sa bonne tolérance après administration intravitréenne ont été validées respectivement chez la souris, le lapin et le primate non humain [ 161], ouvrant ainsi la voie au lancement de l'étude clinique de phase 1b/2 chez l'homme (PQ-110-001, NCT03140969).
Cette étude multicentrique a évalué la sécurité, la tolérabilité et l'efficacité du sepofarsen chez 6 adultes (19-44 ans) et 5 enfants (8-16 ans) atteints de dégénérescence rétinienne liée au gène CEP290 (participants porteurs des variants bialléliques, dont au moins une était l'allèle commun c.2991+1655A>G). Les participants ont été traités selon un schéma de charge/entretien de 160/80 μg ou 320/160 μg, espacés de 3 mois pendant 12 mois (avec un maximum de 4 injections, la majorité ayant reçu trois injections). Des améliorations cliniquement significatives ont été observées dans l'acuité visuelle corrigée maximale (AVCM), les seuils de sensibilité du champ visuel ( full-field stimulus threshold [FST]), ainsi que dans les scores du parcours de mobilité des yeux traités par rapport aux yeux non traités. Aucun signe d'inflammation n'a été observé, mais des effets indésirables de sévérité variable ont été notés, notamment des cataractes nécessitant une intervention. Aux doses les plus élevées (320 μg/160 μg), des cas d'œdème maculaire et d'amincissement rétinien ont été rapportés, conduisant à restreindre les investigations au schéma de charge/entretien de 160/80 μg et à prolonger l'intervalle entre les injections de 3 à 6 mois [162-163-164].
Un participant de cette cohorte initiale, âgé de 14 ans lors de son inclusion, a été suivi régulièrement pendant 4 ans après des injections intravitréennes de sepofarsen à 160 μg; d'abord dans l'œil gauche, puis 15 mois plus tard dans l'œil droit, et enfin une réinjection dans l'œil gauche 2,75 ans après celle de l'œil droit. La fonction visuelle (acuité corrigée standard et basse luminance, micropérimétrie, périmétrie chromatique en condition d'adaptation à l'obscurité, sensibilité rétinienne en champ complet) et la structure rétinienne (imagerie OCT; intensité de la bande IS/OS) ont montré des améliorations transitoires au niveau de la fovéa, avec un pic entre 3 et 6 mois, un maintien au-dessus du niveau initial pendant environ 2 ans, puis un retour aux valeurs de base entre 3 et 4 ans après chaque injection. Ces données confirment une amélioration nette de la sensibilité des photorécepteurs à cônes fovéaux induite par sepofarsen. L'amélioration visuelle apparaît lentement, atteint un pic, puis diminue très progressivement. Cette cinétique, initialement inattendue, pourrait s'expliquer par la demi-vie prolongée de l'oligonucléotide et par l'équilibre dynamique entre la synthèse de nouvelles protéines CEP290 induite par l'ASO et leur dégradation naturelle, lente, dans les cônes fovéaux humains. Ces observations suggèrent que des traitements ASO espacés pourraient offrir des bénéfices prolongés avec un nombre réduit d'injections. Sur cette base, les auteurs ont proposé des réinjections espacées d'au moins 2 ans, permettant de maintenir l'efficacité tout en limitant le risque de toxicité [165 , 166].
Outre ce patient, cinq autres participants parmi les 11 ont été sélectionnés pour une analyse approfondie dans le cadre de l'essai de phase 1b/2. Recrutés dans différents centres et âgés de 15 à 41 ans, ils présentaient à l'inclusion une perception lumineuse bilatérale ainsi que des altérations sévères aux tests FST et au réflexe pupillaire à la lumière transmise ( transient pupillary light reflex [TPLR]). À 3 mois post-injection, les yeux traités montraient une amélioration significative du seuil FST, tandis que les yeux non traités restaient inchangés. L'absence de différence entre les seuils FST bleu et rouge suggère une implication des cônes dans la vision résiduelle. Les réponses TPLR se sont également améliorées dans les yeux traités, sans modification dans les yeux contrôles. Ces résultats objectifs et reproductibles confirment un gain de sensibilité à la lumière après traitement intravitréen. Toutefois, la transposition de cette amélioration en gain fonctionnel (vision spatiale) semble dépendre d'une stimulation visuelle antérieure au cours du développement cérébral, suggérant un bénéfice maximal en cas d'intervention précoce, avant la maturation du cortex visuel [166].
Les résultats de l'étude de phase 1b/2 et du suivi à long terme ont conduit à la mise en place de l'essai clinique de phase 2/3 randomisé, en double aveugle contre placebo (ILLUMINATE : PQ-110-003/NCT03913143), visant à évaluer l'efficacité du sepofarsen chez les patients atteints de la dégénérescence rétinienne liée au gène CEP290 . Cette étude a inclus 36 participants, adultes et enfants de plus de 8 ans, répartis en trois groupes de 12 recevant des doses de charge/entretien de 160/80 μg, 80/40 μg ou un placebo, administrées à 3 et 9 mois. L'AVCM à 12 mois était le critère principal, tandis que les seuils FST, les scores du parcours de mobilité et l'OCT étaient des critères secondaires. Les résultats de l'analyse globale de l'essai n'ont pas montré de différence statistiquement significative entre l'œil traité par sepofarsen et le groupe placebo, ni pour le critère principal, ni pour les critères secondaires. Cependant, des analyses post-hoc ont révélé des résultats intéressants lorsque l'on comparait l'œil traité à l'œil non traité du même patient. Une amélioration moyenne de –0,12 LogMAR de l'AVCM a été observée à 12 mois chez les patients ayant reçu le traitement, ce qui confirme les résultats de l'étude de phase 1b/2 et du suivi à long terme. D'autres critères d'évaluation, tels que les seuils de sensibilité du champ visuel et les scores du parcours de mobilité, ont également montré des résultats favorables en faveur de l'œil traité comparé à l'œil non traité, ce qui suggère que le sepofarsen pourrait avoir un effet bénéfique localisé. De plus, 61 % des patients dans les groupes traités ont signalé une amélioration subjective de leur vision, soutenant ainsi les données objectives obtenues lors des analyses cliniques [167].
Bien que l'objectif principal de l'étude n'ait pas été atteint sur l'ensemble de la cohorte, les résultats suggèrent que le sepofarsen pourrait améliorer la vision dans l'ACL liée au gène CEP290 , en particulier lorsqu'on compare l'œil traité à l'œil non traité. Ces données ont relancé la réflexion sur les critères d'évaluation des thérapies pour les maladies rares associées à une malvoyance profonde, soulignant les limites des comparaisons interindividuelles au profit d'une approche œil traité versus œil non traité (le patient étant son propre témoin), plus pertinente pour ces affections rares, sévères et dégénératives. Ces conclusions ont été prises en compte par les autorités de santé, qui ont autorisé le lancement d'un nouvel essai multicentrique de phase 3, contre placebo et en double aveugle, suivant ce schéma (HYPERION, Sepul Bio; NCT06891443). Le recrutement des patients était en cours au moment de la rédaction de cette revue. À noter qu'une extension aux jeunes enfants avait été prévue avant la publication des résultats de l'étude ILLUMINATE (étude BRIGHTEN d'escalade de dose de phase 2/3 chez les enfants de moins de 8 ans; PQ-110-005/NCT04855045), mais le statut actuel de cette extension n'est pas précisé.
Redirection de l'épissage : ABCA4, une cible majeure en première ligne
Avec l'avènement du séquençage du génome à titre diagnostique, de nombreux variants introniques à distance des sites consensus aux jonctions entre exon-intron sont désormais identifiées. Le faible coût des ASO et la simplicité de leur conception ont motivé de nombreuses études visant à corriger les défauts d'épissage associés, notamment dans des modèles cellulaires ou des organoïdes rétiniens dérivés de cellules de patients. Cependant, ces travaux se limitent généralement à l'établissement de la preuve de concept de la thérapie ASO, sans réelle perspective de transition vers la clinique. Les variants introniques du gène ABCA4 font figure d'exception.
Tout comme CEP290 , ABCA4 (MIM 601691; Gene ID : 24) constitue une cible thérapeutique majeure qui échappe à la thérapie génique utilisant les vecteurs AAV, mais représente une cible idéale pour les thérapies ASO. Ce gène, localisé sur le bras court du chromosome 1, s'étend sur 128000 nucléotides et comprend 50 exons séparés par 49 introns, pour une séquence codante de 6819 nucléotides ( Gene ID : 24), dépassant très largement les capacités d'encapsidation des vecteurs AAV. Sa traduction produit une protéine membranaire des disques des photorécepteurs, essentielle à la réactivation des photopigments désactivés par l'illumination de la rétine [168]. Plus de 2000 variants différents du gène ABCA4 ont été identifiés chez des patients atteints de STGD1, des formes juvénile et adulte de la maladie de Stargardt, de près de 20 % des dystrophies cônes-bâtonnets récessives autosomiques et, parfois, des dystrophies bâtonnets-cônes [169], voire des EOSRD ( early-onset severe retinal dystrophies ) [ 170], totalisant environ 30 % des cas de dystrophies rétiniennes héréditaires. Ces variants sont répartis largement sur les régions exoniques et introniques du locus ABCA4 ( www.lovd.nl/ABCA4). Les variants qui affectent l'épissage du pré-ARNm, dont environ la moitié sont des variants introniques profonds entraînant l'insertion de pseudo-exons dans l'ARN messager, représentent une proportion importante des variants pathogènes rapportés et constituent désormais une cible attractive pour les thérapies géniques [171-172-173-174]. Parmi ces variants, plusieurs présentent une fréquence relativement élevée et/ou font l'objet de développements précliniques actifs en vue d'une traduction clinique via des thérapies antisens [] (tableau 45-3
Tableau 45-3
Variants du gène ABCA4 faisant l'objet de développements thérapeutiques utilisant des oligonucléotides antisens (ASO).
Sangermano et al., 2016, 2019; Kaltak et al., 2023-2024
c.5461−8T>G
Intron 38, site accepteur d'épissage
Exclusion de l'exon 39 → transcrits tronqués; partiellement corrigée par QR-1011
ASO QR-1011; PP
Kaltak et al., 2024
c.5461−6T>C
Intron 38, site accepteur d'épissage
Exon 39 exclu → faible réponse au QR-1011
ASO QR-1011; PP
Kaltak et al., 2024
c.5584+5G>A
Intron 39, site donneur d'épissage
Épissage très perturbé → exclusion partielle ou totale de l'exon 39
ASO QR-1011
Kaltak et al., 2024
c.5584+6T>C
Intron 39, site donneur d'épissage
Épissage partiellement perturbé; correction partielle par QR-1011
ASO QR-1011
Kaltak et al., 2024
c.769-784C>T
Intron 6, intronique profond
Activation d'un site accepteur cryptique → pseudo-exon de 162 nt → codon stop prématuré
ASO; multiASO-AAV U7snRNA; minigène
Sangermano et al., 2019; Tomkiewicz et al., 2022
c.4253+43G>A
Intron 28, NCSS/modérément profond
Activation d'un pseudo-exon de 100 nt → codon stop prématuré
Minigène
Sangermano et al., 2019
c.4539+2001G>A
Intron 30, intronique profond
Pseudo-exon de 345 nt (spécifique rétine) → codon stop; correction par ASO testée sur PP
ASO; multiASO-AAV U7snRNA; PP
Albert et al., 2018; Garanto et al., 2019
c.4539+2028C>T
Intron 30, proche de +2001G>A
Même pseudo-exon → codon stop prématuré; testé in vitro
ASO; multiASO-AAV U7snRNA; minigène
Albert et al., 2018
c.4539+1100A>G
Intron 30, intronique profond
Pseudo-exon activé → codon stop prématuré
MultiASO-AAV U7snRNA; minigène
Sangermano et al., 2019
c.4539+1106C>T
Intron 30, intronique profond
Pseudo-exon activé → codon stop prématuré
MultiASO-AAV U7snRNA; minigène
Sangermano et al., 2019
c.859-506G>C
Intron 7, intronique profond
Activation d'un pseudo-exon → codon stop prématuré
MultiASO-AAV U7snRNA; minigène
Sangermano et al., 2019
c.5714+5G>A
Intron 39, site donneur d'épissage
Défaut d'épissage confirmé par minigène
MultiASO-AAV U7snRNA; minigène
Sangermano et al., 2018
c.1937+13T>G
Intron 13, site donneur d'épissage
Allongement d'exon → codon stop prématuré
Minigène
Sangermano et al., 2018
c.4538A>G/c.4538A>C
Exon 30, site donneur de l'exon
Exon allongé ou délétions complexes → transcrits aberrants
Minigène
Sangermano et al., 2018
c.5196+1056A>G
Intron 36, intronique profond
Activation d'un site donneur cryptique → pseudo-exon inclus → codon stop prématuré
MultiASO-AAV U7snRNA; minigène
Zernant et al., 2018
c.768G>T
Exon 6/intron 6, jonction exon-intron
Skipping de l'exon 6 → transcrits tronqués; testé avec ASO préclinique
ASO
Karjosukarso et al., 2025
NCSS : non-canonical splice-site (site d'épissage non canonique; PP : précurseur de photorécepteur.
). Des travaux sont en cours pour développer des ASO capables de cibler simultanément plusieurs variants soit en exploitant leur proximité avec des variants fréquents [186], soit via l'utilisation d'un vecteur U7snRNA unique délivrant plusieurs ASO afin de corriger l'épissage de divers variants du gène ABCA4 [183] (voir tableau 45-3
Tableau 45-3
Variants du gène ABCA4 faisant l'objet de développements thérapeutiques utilisant des oligonucléotides antisens (ASO).
Sangermano et al., 2016, 2019; Kaltak et al., 2023-2024
c.5461−8T>G
Intron 38, site accepteur d'épissage
Exclusion de l'exon 39 → transcrits tronqués; partiellement corrigée par QR-1011
ASO QR-1011; PP
Kaltak et al., 2024
c.5461−6T>C
Intron 38, site accepteur d'épissage
Exon 39 exclu → faible réponse au QR-1011
ASO QR-1011; PP
Kaltak et al., 2024
c.5584+5G>A
Intron 39, site donneur d'épissage
Épissage très perturbé → exclusion partielle ou totale de l'exon 39
ASO QR-1011
Kaltak et al., 2024
c.5584+6T>C
Intron 39, site donneur d'épissage
Épissage partiellement perturbé; correction partielle par QR-1011
ASO QR-1011
Kaltak et al., 2024
c.769-784C>T
Intron 6, intronique profond
Activation d'un site accepteur cryptique → pseudo-exon de 162 nt → codon stop prématuré
ASO; multiASO-AAV U7snRNA; minigène
Sangermano et al., 2019; Tomkiewicz et al., 2022
c.4253+43G>A
Intron 28, NCSS/modérément profond
Activation d'un pseudo-exon de 100 nt → codon stop prématuré
Minigène
Sangermano et al., 2019
c.4539+2001G>A
Intron 30, intronique profond
Pseudo-exon de 345 nt (spécifique rétine) → codon stop; correction par ASO testée sur PP
ASO; multiASO-AAV U7snRNA; PP
Albert et al., 2018; Garanto et al., 2019
c.4539+2028C>T
Intron 30, proche de +2001G>A
Même pseudo-exon → codon stop prématuré; testé in vitro
ASO; multiASO-AAV U7snRNA; minigène
Albert et al., 2018
c.4539+1100A>G
Intron 30, intronique profond
Pseudo-exon activé → codon stop prématuré
MultiASO-AAV U7snRNA; minigène
Sangermano et al., 2019
c.4539+1106C>T
Intron 30, intronique profond
Pseudo-exon activé → codon stop prématuré
MultiASO-AAV U7snRNA; minigène
Sangermano et al., 2019
c.859-506G>C
Intron 7, intronique profond
Activation d'un pseudo-exon → codon stop prématuré
MultiASO-AAV U7snRNA; minigène
Sangermano et al., 2019
c.5714+5G>A
Intron 39, site donneur d'épissage
Défaut d'épissage confirmé par minigène
MultiASO-AAV U7snRNA; minigène
Sangermano et al., 2018
c.1937+13T>G
Intron 13, site donneur d'épissage
Allongement d'exon → codon stop prématuré
Minigène
Sangermano et al., 2018
c.4538A>G/c.4538A>C
Exon 30, site donneur de l'exon
Exon allongé ou délétions complexes → transcrits aberrants
Minigène
Sangermano et al., 2018
c.5196+1056A>G
Intron 36, intronique profond
Activation d'un site donneur cryptique → pseudo-exon inclus → codon stop prématuré
MultiASO-AAV U7snRNA; minigène
Zernant et al., 2018
c.768G>T
Exon 6/intron 6, jonction exon-intron
Skipping de l'exon 6 → transcrits tronqués; testé avec ASO préclinique
ASO
Karjosukarso et al., 2025
NCSS : non-canonical splice-site (site d'épissage non canonique; PP : précurseur de photorécepteur.
).
Les variants impactant l'épissage situés près des sites consensus, aux jonctions exon-intron, voire dans les exons eux-mêmes, présentent un défi plus complexe. Ils perturbent l'épissage en altérant les sites de reconnaissance du splicéosome, entraînant des défauts variés, notamment des sauts d'exon complets ou partiels et des rétentions de séquences introniques. La nature essentielle et conservée de ces régions consensuelles limite les cibles accessibles pour les ASO, augmentant le risque d'effets non spécifiques ou d'aggravation des anomalies d'épissage. La correction de ces variants par ASO reste difficile, car elle nécessite un ciblage d'une extrême précision sans compromettre l'épissage normal, ce qui constitue un défi technique majeur. Toutefois, certains variants très fréquents, tels que le variant c.5461-10T>C localisé dans l'intron 39 [ 181 , 188] – et, par extension, les variants situés à sa proximité immédiate [182] –, ou encore le variant c.768G>T à la jonction exon 6/intron 6 [187], font actuellement l'objet de développements précliniques prometteurs, ouvrant de réelles perspectives cliniques (voir tableau 45-3
Tableau 45-3
Variants du gène ABCA4 faisant l'objet de développements thérapeutiques utilisant des oligonucléotides antisens (ASO).
Sangermano et al., 2016, 2019; Kaltak et al., 2023-2024
c.5461−8T>G
Intron 38, site accepteur d'épissage
Exclusion de l'exon 39 → transcrits tronqués; partiellement corrigée par QR-1011
ASO QR-1011; PP
Kaltak et al., 2024
c.5461−6T>C
Intron 38, site accepteur d'épissage
Exon 39 exclu → faible réponse au QR-1011
ASO QR-1011; PP
Kaltak et al., 2024
c.5584+5G>A
Intron 39, site donneur d'épissage
Épissage très perturbé → exclusion partielle ou totale de l'exon 39
ASO QR-1011
Kaltak et al., 2024
c.5584+6T>C
Intron 39, site donneur d'épissage
Épissage partiellement perturbé; correction partielle par QR-1011
ASO QR-1011
Kaltak et al., 2024
c.769-784C>T
Intron 6, intronique profond
Activation d'un site accepteur cryptique → pseudo-exon de 162 nt → codon stop prématuré
ASO; multiASO-AAV U7snRNA; minigène
Sangermano et al., 2019; Tomkiewicz et al., 2022
c.4253+43G>A
Intron 28, NCSS/modérément profond
Activation d'un pseudo-exon de 100 nt → codon stop prématuré
Minigène
Sangermano et al., 2019
c.4539+2001G>A
Intron 30, intronique profond
Pseudo-exon de 345 nt (spécifique rétine) → codon stop; correction par ASO testée sur PP
ASO; multiASO-AAV U7snRNA; PP
Albert et al., 2018; Garanto et al., 2019
c.4539+2028C>T
Intron 30, proche de +2001G>A
Même pseudo-exon → codon stop prématuré; testé in vitro
ASO; multiASO-AAV U7snRNA; minigène
Albert et al., 2018
c.4539+1100A>G
Intron 30, intronique profond
Pseudo-exon activé → codon stop prématuré
MultiASO-AAV U7snRNA; minigène
Sangermano et al., 2019
c.4539+1106C>T
Intron 30, intronique profond
Pseudo-exon activé → codon stop prématuré
MultiASO-AAV U7snRNA; minigène
Sangermano et al., 2019
c.859-506G>C
Intron 7, intronique profond
Activation d'un pseudo-exon → codon stop prématuré
MultiASO-AAV U7snRNA; minigène
Sangermano et al., 2019
c.5714+5G>A
Intron 39, site donneur d'épissage
Défaut d'épissage confirmé par minigène
MultiASO-AAV U7snRNA; minigène
Sangermano et al., 2018
c.1937+13T>G
Intron 13, site donneur d'épissage
Allongement d'exon → codon stop prématuré
Minigène
Sangermano et al., 2018
c.4538A>G/c.4538A>C
Exon 30, site donneur de l'exon
Exon allongé ou délétions complexes → transcrits aberrants
Minigène
Sangermano et al., 2018
c.5196+1056A>G
Intron 36, intronique profond
Activation d'un site donneur cryptique → pseudo-exon inclus → codon stop prématuré
MultiASO-AAV U7snRNA; minigène
Zernant et al., 2018
c.768G>T
Exon 6/intron 6, jonction exon-intron
Skipping de l'exon 6 → transcrits tronqués; testé avec ASO préclinique
ASO
Karjosukarso et al., 2025
NCSS : non-canonical splice-site (site d'épissage non canonique; PP : précurseur de photorécepteur.
).
Saut d'exon : exemple de l'ultevursen et prochaines cibles crédibles
Des ASO peuvent être conçus pour se lier à des sites contenant des signaux canoniques d'épissage sur le pré-ARNm, empêchant ainsi le recrutement des protéines du splicéosome et altérant de manière ciblée l'épissage normalement attendu (voir fig. 45-8
Fig. 45-8Modulation de l'épissage par les oligonucléotides antisens (ASO) pour corriger des variants génétiques. 1. Redirection de l'épissage. Certains variants (*) peuvent induire un ou plusieurs événements d'épissage anormal (rouge). Les ASO (peignes verts) peuvent réorienter l'épissage de l'ARN pré-messager vers les sites consensus (bleu) en se fixant sur des séquences exoniques ou introniques, qu'elles soient activatrices ou inhibitrices de l'épissage. 1.1. Un variant affectant un site consensus d'épissage à la jonction exon-intron peut rediriger l'épissage vers : a) un site consensus alternatif situé dans l'intron suivant, conduisant à un saut d'exon; b, c) des sites cryptiques normalement silencieux (rectangles en pointillé vert), localisés soit dans les exons (perte partielle de l'exon, b), soit dans les introns (rétention partielle de l'intron, c). En bloquant des séquences inhibitrices de l'épissage (ESS ou ISS), les ASO permettent de rétablir l'utilisation correcte des sites consensus. 1.2. Un variant exonique faux-sens (substitution d'un acide aminé par un autre) ou silencieuse (sans modification de la séquence protéique) peut également perturber l'épissage. Ces variants sont susceptibles d'induire un saut d'exon complet (a) ou partiel (b). En se fixant sur la séquence mutée, un ASO peut corriger ce défaut et rétablir un ARNm normal. 1.3. Un variant intronique profond peut créer et/ou activer des sites cryptiques d'épissage, entraînant l'insertion d'un pseudo-exon dans l'ARNm. En ciblant la séquence mutée ou les signaux régulateurs voisins, un ASO peut empêcher ce défaut et restaurer un ARNm correct. 2. Saut d'exon. Les variants introduisant un codon stop prématuré peuvent être contournés par l'induction d'un saut d'exon, à condition que ce saut conserve le cadre de lecture. En bloquant la reconnaissance de l'exon contenant le variant (codon stop prématuré, représenté en rouge), les ASO favorisent son exclusion de l'ARNm, permettant la synthèse d'une protéine tronquée mais fonctionnelle. 3. TANGO (targeted augmentation of nuclear gene output). De nombreux gènes subissent un épissage alternatif qui génère plusieurs isoformes protéiques à partir d'un même ARN pré-messager. Les ASO peuvent moduler cet épissage en bloquant sélectivement certains sites, favorisant ainsi la production d'isoformes spécifiques.
Source : J.-M. Rozet.
). Ces ASO peuvent être utilisés pour exclure du transcrit d'ARNm mature les exons porteurs de variants délétères, tels que ceux entraînant une absence de protéine (haplo-insuffisance), et permettre ainsi la production d'une protéine, au moins partiellement fonctionnelle (voir fig. 45-8
Fig. 45-8Modulation de l'épissage par les oligonucléotides antisens (ASO) pour corriger des variants génétiques. 1. Redirection de l'épissage. Certains variants (*) peuvent induire un ou plusieurs événements d'épissage anormal (rouge). Les ASO (peignes verts) peuvent réorienter l'épissage de l'ARN pré-messager vers les sites consensus (bleu) en se fixant sur des séquences exoniques ou introniques, qu'elles soient activatrices ou inhibitrices de l'épissage. 1.1. Un variant affectant un site consensus d'épissage à la jonction exon-intron peut rediriger l'épissage vers : a) un site consensus alternatif situé dans l'intron suivant, conduisant à un saut d'exon; b, c) des sites cryptiques normalement silencieux (rectangles en pointillé vert), localisés soit dans les exons (perte partielle de l'exon, b), soit dans les introns (rétention partielle de l'intron, c). En bloquant des séquences inhibitrices de l'épissage (ESS ou ISS), les ASO permettent de rétablir l'utilisation correcte des sites consensus. 1.2. Un variant exonique faux-sens (substitution d'un acide aminé par un autre) ou silencieuse (sans modification de la séquence protéique) peut également perturber l'épissage. Ces variants sont susceptibles d'induire un saut d'exon complet (a) ou partiel (b). En se fixant sur la séquence mutée, un ASO peut corriger ce défaut et rétablir un ARNm normal. 1.3. Un variant intronique profond peut créer et/ou activer des sites cryptiques d'épissage, entraînant l'insertion d'un pseudo-exon dans l'ARNm. En ciblant la séquence mutée ou les signaux régulateurs voisins, un ASO peut empêcher ce défaut et restaurer un ARNm correct. 2. Saut d'exon. Les variants introduisant un codon stop prématuré peuvent être contournés par l'induction d'un saut d'exon, à condition que ce saut conserve le cadre de lecture. En bloquant la reconnaissance de l'exon contenant le variant (codon stop prématuré, représenté en rouge), les ASO favorisent son exclusion de l'ARNm, permettant la synthèse d'une protéine tronquée mais fonctionnelle. 3. TANGO (targeted augmentation of nuclear gene output). De nombreux gènes subissent un épissage alternatif qui génère plusieurs isoformes protéiques à partir d'un même ARN pré-messager. Les ASO peuvent moduler cet épissage en bloquant sélectivement certains sites, favorisant ainsi la production d'isoformes spécifiques.
Source : J.-M. Rozet.
). Toutefois, pour que cette stratégie soit efficace, il est essentiel que le saut de l'exon conserve un cadre de lecture ouvert, ce qui peut nécessiter le saut de plusieurs exons consécutifs, et n'entraîne pas la perte d'une portion codante cruciale pour la stabilité et/ou la fonction du produit protéique (voir fig. 45-8
Fig. 45-8Modulation de l'épissage par les oligonucléotides antisens (ASO) pour corriger des variants génétiques. 1. Redirection de l'épissage. Certains variants (*) peuvent induire un ou plusieurs événements d'épissage anormal (rouge). Les ASO (peignes verts) peuvent réorienter l'épissage de l'ARN pré-messager vers les sites consensus (bleu) en se fixant sur des séquences exoniques ou introniques, qu'elles soient activatrices ou inhibitrices de l'épissage. 1.1. Un variant affectant un site consensus d'épissage à la jonction exon-intron peut rediriger l'épissage vers : a) un site consensus alternatif situé dans l'intron suivant, conduisant à un saut d'exon; b, c) des sites cryptiques normalement silencieux (rectangles en pointillé vert), localisés soit dans les exons (perte partielle de l'exon, b), soit dans les introns (rétention partielle de l'intron, c). En bloquant des séquences inhibitrices de l'épissage (ESS ou ISS), les ASO permettent de rétablir l'utilisation correcte des sites consensus. 1.2. Un variant exonique faux-sens (substitution d'un acide aminé par un autre) ou silencieuse (sans modification de la séquence protéique) peut également perturber l'épissage. Ces variants sont susceptibles d'induire un saut d'exon complet (a) ou partiel (b). En se fixant sur la séquence mutée, un ASO peut corriger ce défaut et rétablir un ARNm normal. 1.3. Un variant intronique profond peut créer et/ou activer des sites cryptiques d'épissage, entraînant l'insertion d'un pseudo-exon dans l'ARNm. En ciblant la séquence mutée ou les signaux régulateurs voisins, un ASO peut empêcher ce défaut et restaurer un ARNm correct. 2. Saut d'exon. Les variants introduisant un codon stop prématuré peuvent être contournés par l'induction d'un saut d'exon, à condition que ce saut conserve le cadre de lecture. En bloquant la reconnaissance de l'exon contenant le variant (codon stop prématuré, représenté en rouge), les ASO favorisent son exclusion de l'ARNm, permettant la synthèse d'une protéine tronquée mais fonctionnelle. 3. TANGO (targeted augmentation of nuclear gene output). De nombreux gènes subissent un épissage alternatif qui génère plusieurs isoformes protéiques à partir d'un même ARN pré-messager. Les ASO peuvent moduler cet épissage en bloquant sélectivement certains sites, favorisant ainsi la production d'isoformes spécifiques.
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). Elle est actuellement en phase d'essai clinique pour le gène USH2A (MIM 608400, Gene ID : 7399). Ce gène comprend 72 exons et plus de 2000 variants différents ont été rapportés ( www.LOVD.nl/USH2A), responsables d'environ 85 % des syndromes d'Usher de type 2 et de 8 % à 22 % des rétinopathies pigmentaires récessives autosomiques (RPar) [189 , 190]. USH2A code l'usherine (environ 600 kDa; UniProtKB O75445), une protéine du complexe macromoléculaire USH, localisé à la membrane périciliaire entourant le cil connecteur des photorécepteurs et les stéréocils des cellules ciliées cochléaires, essentiel à leur développement et ou maintien [189 , 190]. Bien qu'il s'agisse d'une cible thérapeutique majeure en raison de la prévalence et de la sévérité des atteintes sensorielles associées, la taille importante de sa séquence codante (15606 nucléotides) compromet le recours aux vecteurs AAV pour la thérapie génique.
Cependant, les deux variants les plus fréquents du gène USH2A , c.2299delG (p.Glu767Serfs*21) – responsable à lui seul d'environ 25 % des allèles pathogènes – et c.2276G>T [p.Cys759Phe], sont tous deux situés dans l'exon 13, où ils induisent un codon stop prématuré, entraînant l'absence d'expression de la protéine Usherine [133].
L'ultevursen (QR-421a) est un ASO simple brin de 21 bases, modifié par des groupements 2′-O-(2-méthoxyéthyle) et des liaisons phosphorothioates, offrant une stabilité et une spécificité accrues par rapport aux AON 2′-O-méthyl-PS. Il cible le pré-ARNm d' USH2A et en modifie l'épissage en excluant l'exon 13, sans perturber le cadre de lecture, permettant ainsi la synthèse d'une forme tronquée, mais potentiellement fonctionnelle d'Usherine, privée de 63 acides aminés non essentiels (voir fig. 45-9
Fig. 45-9Thérapies par oligonucléotides antisens (ASO) en cours d'essai clinique. Pour chaque cible, sont représentés, de haut en bas : le gène et sa localisation chromosomique, l'ARN pré-messager (avec les sites consensus d'épissage aux jonctions intron-exon indiqués par des rectangles pleins et les sites cryptiques par des rectangles en pointillés, en bleu pour la situation normale et en rouge pour la situation pathologique), l'ARN messager et la protéine; et de droite à gauche la situation normale, pathologique (les variants sont symbolisés par une étoile rouge au niveau du gène et de son ARN pré-messager, et par un codon stop lorsqu'ils introduisent un codon de terminaison prématuré dans l'ARN messager) et l'effet attendu du traitement par ASO. Un seul allèle est représenté pour CEP290 et USH2A, dont les maladies associées sont de transmission autosomique récessive. En revanche, les deux allèles, normal et mutant, sont présentés pour RHO et OPA1, dont les variants sont responsables de maladies à transmission autosomique dominante. Dans le cas d'OPA1, le variant est représenté de façon arbitraire dans l'exon 5, mais l'approche TANGO vise des mécanismes d'épissage qui dépassent cet exon.
Source : J.-M. Rozet.
). Dans le modèle zebrafish ush2armc1, qui porte un variant induisant un décalage du cadre de lecture analogue à c.2299delG, l'exclusion de l'exon 13 induite par l'ultevursen a restauré l'expression de la protéine et amélioré les réponses électrorétinographiques (ERG), sévèrement altérées en l'absence de traitement [133 , 191].
Ces résultats ont conduit au lancement de l'essai multicentrique STELLAR de phase 1b/2 (PQ-421a-001/NCT03780257), visant à évaluer la sécurité et l'efficacité d'une injection intravitréenne unique de 50, 100 ou 200 μg d'ultevursen chez des patients de 18 ans ou plus porteurs de variants bialléliques d' USH2A , dont au moins un variant dans l'exon 13, notamment les variants c.2299delG et c.2276G>T. Vingt patients ont été inclus, dont 14 ont reçu l'ultevursen et 6 un placebo, de manière randomisée. Les résultats intérimaires à 11 mois ont montré une très bonne tolérance du traitement, sans événements indésirables graves, ni inflammation, quelle que soit la dose. Seuls deux malades ont présenté une aggravation d'atteintes préexistantes : cataracte (non liée au traitement) et œdème maculaire cystoïde (géré par traitement standard). À 11 mois, l'AVCM est restée stable dans les yeux traités, contrairement aux yeux non traités et traités par placebo où un déclin a été observé, conformément à l'histoire naturelle de la maladie. Ces résultats étaient cohérents avec les améliorations fonctionnelles observées à 3 mois, où la périmétrie statique a révélé une amélioration de la sensibilité rétinienne à la lumière, notamment par une augmentation du nombre de loci ayant amélioré de 7 dB ou plus, et à 6 mois, avec la mesure de l'aire de la zone ellipsoïde à l'OCT, montrant une augmentation de 40 % par rapport aux yeux non traités et de 30 % par rapport aux yeux sous placebo, où l'aire avait diminué.
Ces résultats ont montré le potentiel de l'ASO pour stabiliser la maladie et améliorer la sensibilité rétinienne, même à faible dose, contrairement au groupe placebo, où aucun effet bénéfique n'a été observé. Ces constatations ont conduit à la mise en place de l'étude HELIA (PQ-421a-002/NCT05085964), une extension de STELLAR, visant à évaluer la sécurité, la tolérabilité et l'efficacité de l'administration répétée de l'ultevursen dans un ou les deux yeux des participants de l'étude STELLAR, ainsi que chez des patients de 12 ans et plus, également porteurs de variants bialléliques d' USH2A , dont au moins un dans l'exon 13. Parallèlement, l'étude multicentrique, en double aveugle, randomisée et contrôlée par placebo (SIRIUS, PQ-421a-003; NCT05158296), a été lancée sur 24 mois, avec des doses multiples, pour approfondir l'évaluation de l'ASO dans le cadre d'une phase 2/3.
Saut d'exon : ABCA4 et CEP290, prochaines cibles crédibles
D'autres gènes de grande taille, présentant des sites de variants récurrents dans un exon, dont le saut permet la production d'un ARNm mature codant une protéine fonctionnelle partielle ou complète, font l'objet de développements précliniques prometteurs. C'est notamment le cas des exons 17 et 36 des gènes ABCA4 et CEP290 , respectivement.
Le saut de l'exon 17 du gène ABCA4 à des fins thérapeutiques a été envisagé après une étude de caractérisation d'un variant intronique affectant le site consensus d'épissage de l'intron 17, identifié chez un patient atteint de la maladie de Stargardt [ 181]. Après avoir montré que ce variant entraîne l'exclusion de l'exon 17 de l'ARNm sans provoquer de décalage du cadre de lecture, l'activité de la protéine produite par cet ARNm amputé de l'exon 17 a été étudiée, révélant que les 22 acides aminés codés par cet exon, reliant deux domaines fonctionnels, ne sont pas cruciaux pour la fonction de la protéine. Ces résultats ont conduit au développement d'ASO conçus pour induire l'exclusion de l'exon 17, pouvant potentiellement être utilisés pour traiter les variantes sévères présentes dans cet exon et augmenter l'activité résiduelle d' ABCA4 chez les patients atteints de STGD1 [ 181]. En effet, au moins 14 variants génétiques ont déjà été rapportés dans cet exon 17, dont la plupart ont un effet délétère démontré sur la protéine. Une telle approche pourrait être étendue à d'autres exons du gène ABCA4 parmi les 16 autres exons (sur un total de 50), dont le saut préserverait le cadre de lecture, laissant espérer – bien que cela reste à démontrer – la production d'une protéine fonctionnelle [ 181].
Concernant le gène CEP290 , plusieurs études ont montré l'existence de phénotypes rétiniens atténués par rapport à l'ACL, le phénotype oculaire traditionnellement associé à ce gène. Ces déviations ont été expliquées par un saut spontané des exons portant des variants introduisant un codon prématuré d'arrêt de la traduction, permettant ainsi le rétablissement d'un cadre ouvert de lecture et la production d'une protéine amputée de quelques acides aminés, mais néanmoins fonctionnelle [192]. Ces observations ont conduit au développement d'une thérapie antisens ciblant l'exon 36, l'un des 27 exons en phase parmi les 55 exons du gène CEP290 , choisi en raison du variant non-sens c.4723A>T, fondateur dans les Flandres (France, Belgique, Pays-Bas), où il est très récurrent, représentant au moins 2,5 % des cas d'ACL recrutés en France [ 193]. Les études précliniques menées sur des fibroblastes de patients présentant des défauts de ciliation associés à une déficience fonctionnelle de CEP290 ont montré une amélioration du phénotype ciliaire après l'administration d'un ASO conçu pour induire le saut de l'exon 36, suggérant un potentiel thérapeutique pour corriger les variants situés dans cet exon [ 159]. De plus, la délétion homozygote de cet exon chez la souris a révélé un ralentissement significatif de la dégénérescence rétinienne par rapport aux animaux porteurs d'un ou de deux variants tronquants dans cet exon [données personnelles]. Ces résultats suggèrent que la suppression de l'exon 36 pourrait avoir un effet protecteur contre la progression de la dégénérescence rétinienne liée à CEP290 .
Manipulation de l'épissage alternatif : des perspectives prometteuses pour la neuropathie optique autosomique dominante
L'épissage alternatif est un mécanisme fondamental de la maturation des ARN pré-messagers, permettant la production de plusieurs isoformes d'ARNm à partir d'un même gène. Ce processus joue un rôle crucial dans la régulation de l'expression génique et dans la diversité fonctionnelle des protéines. L'altération de ce processus peut être impliquée dans diverses pathologies génétiques. Les ASO représentent une approche prometteuse pour moduler spécifiquement l'épissage alternatif en influençant l'inclusion ou l'exclusion d'exons dans le transcrit final pour favoriser l'expression d'une isoforme fonctionnelle en contournant des exons défectueux ou en forçant l'inclusion d'exons qui seraient autrement épissés de manière alternative (voir fig. 45-8
Fig. 45-8Modulation de l'épissage par les oligonucléotides antisens (ASO) pour corriger des variants génétiques. 1. Redirection de l'épissage. Certains variants (*) peuvent induire un ou plusieurs événements d'épissage anormal (rouge). Les ASO (peignes verts) peuvent réorienter l'épissage de l'ARN pré-messager vers les sites consensus (bleu) en se fixant sur des séquences exoniques ou introniques, qu'elles soient activatrices ou inhibitrices de l'épissage. 1.1. Un variant affectant un site consensus d'épissage à la jonction exon-intron peut rediriger l'épissage vers : a) un site consensus alternatif situé dans l'intron suivant, conduisant à un saut d'exon; b, c) des sites cryptiques normalement silencieux (rectangles en pointillé vert), localisés soit dans les exons (perte partielle de l'exon, b), soit dans les introns (rétention partielle de l'intron, c). En bloquant des séquences inhibitrices de l'épissage (ESS ou ISS), les ASO permettent de rétablir l'utilisation correcte des sites consensus. 1.2. Un variant exonique faux-sens (substitution d'un acide aminé par un autre) ou silencieuse (sans modification de la séquence protéique) peut également perturber l'épissage. Ces variants sont susceptibles d'induire un saut d'exon complet (a) ou partiel (b). En se fixant sur la séquence mutée, un ASO peut corriger ce défaut et rétablir un ARNm normal. 1.3. Un variant intronique profond peut créer et/ou activer des sites cryptiques d'épissage, entraînant l'insertion d'un pseudo-exon dans l'ARNm. En ciblant la séquence mutée ou les signaux régulateurs voisins, un ASO peut empêcher ce défaut et restaurer un ARNm correct. 2. Saut d'exon. Les variants introduisant un codon stop prématuré peuvent être contournés par l'induction d'un saut d'exon, à condition que ce saut conserve le cadre de lecture. En bloquant la reconnaissance de l'exon contenant le variant (codon stop prématuré, représenté en rouge), les ASO favorisent son exclusion de l'ARNm, permettant la synthèse d'une protéine tronquée mais fonctionnelle. 3. TANGO (targeted augmentation of nuclear gene output). De nombreux gènes subissent un épissage alternatif qui génère plusieurs isoformes protéiques à partir d'un même ARN pré-messager. Les ASO peuvent moduler cet épissage en bloquant sélectivement certains sites, favorisant ainsi la production d'isoformes spécifiques.
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). Cette stratégie est en cours d'étude pour le traitement des maladies liées au gène OPA1 (MIM 605290), dont les variants dominants (plus de 1300; https://databases.lovd.nl/shared/variants/OPA1) sont responsables de la neuropathie optique dominante [194-195-196], cause la plus fréquente de neuropathie optique héréditaire (prévalence minimale 1/25000 [197]), devant la neuropathie optique de Leber (1/30000-1/50000 [ 198]). À ce jour, aucun traitement curatif n'existe pour cette maladie, qui provoque une perte de vision progressive et irréversible bilatérale, débutant dès la première décennie de la vie, avec une sévérité variable.
La majorité des variants génétiques du gène OPA1 entraînent une haplo-insuffisance, avec des cellules de patients exprimant environ la moitié des niveaux normaux de la protéine OPA1 [ 196]. L'épissage du pré-ARNm d' OPA1 génère au moins 8 isoformes, qui diffèrent par l'inclusion ou l'exclusion de certains exons, influençant ainsi la structure et la fonction des protéines résultantes. Ces isoformes peuvent jouer des rôles distincts dans la dynamique mitochondriale, notamment la fusion des membranes internes et la réponse au stress cellulaire, qui comptent parmi les fonctions connues de cette protéine [ 196]. L'une de ces isoformes inclut un exon comportant un codon stop prématuré, ce qui conduit à l'élimination de l'ARNm et à l'absence de la protéine OPA1 fonctionnelle.
Pour augmenter la production d' OPA1 au-delà de 50 % à partir de l'allèle sauvage, un ASO de type 2′O-méthoxyéthyl-phosphorothioate, nommé STK-002, a été conçu selon la stratégie TANGO décrite plus haut permettant de bloquer l'inclusion d'un exon « non productif» du pré-ARNm d' OPA1 , favorisant la production d'ARNm et de protéine OPA1 fonctionnelle à partir de l'allèle intact (voir fig. 45-9
Fig. 45-9Thérapies par oligonucléotides antisens (ASO) en cours d'essai clinique. Pour chaque cible, sont représentés, de haut en bas : le gène et sa localisation chromosomique, l'ARN pré-messager (avec les sites consensus d'épissage aux jonctions intron-exon indiqués par des rectangles pleins et les sites cryptiques par des rectangles en pointillés, en bleu pour la situation normale et en rouge pour la situation pathologique), l'ARN messager et la protéine; et de droite à gauche la situation normale, pathologique (les variants sont symbolisés par une étoile rouge au niveau du gène et de son ARN pré-messager, et par un codon stop lorsqu'ils introduisent un codon de terminaison prématuré dans l'ARN messager) et l'effet attendu du traitement par ASO. Un seul allèle est représenté pour CEP290 et USH2A, dont les maladies associées sont de transmission autosomique récessive. En revanche, les deux allèles, normal et mutant, sont présentés pour RHO et OPA1, dont les variants sont responsables de maladies à transmission autosomique dominante. Dans le cas d'OPA1, le variant est représenté de façon arbitraire dans l'exon 5, mais l'approche TANGO vise des mécanismes d'épissage qui dépassent cet exon.
Des études in vitro sur des fibroblastes humains, y compris ceux issus de patients atteints d'atrophie optique dominante (ADOA), ont montré que STK-002 réduisait de manière dose-dépendante l'inclusion de l'exon non productif et augmentait la quantité de protéine OPA1 [199]. Dans des cellules présentant une altération de la respiration mitochondriale secondaire à un variant hétérozygote dominant du gène OPA1 , l'administration de STK-002 a entraîné une amélioration significative de la fonction respiratoire, corroborant l'activité fonctionnelle de l'ASO [199].
Les études précliniques in vivo ont confirmé ces résultats. L'administration intravitréenne de STK-002 chez des primates non humains (cynomolgus) a entraîné une augmentation dose-dépendante de la protéine OPA1 dans la rétine, observable dès 4 semaines et maintenue jusqu'à 8 semaines [199]. Les cellules ganglionnaires rétiniennes ont été identifiées comme principales cibles de l'ASO par hybridation in situ et immunohistochimie. Des résultats comparables ont été obtenus chez des lapins traités avec un ASO adapté à la séquence d'OPA1 de cette espèce, confirmant la translationalité du mécanisme [199].
Sur le plan clinique, l'étude OSPREY (phase 1/2), récemment autorisé par le régulateur britannique (Medicines and Healthcare products Regulatory Agency [MHRA]), a été conçu pour évaluer la sécurité, la tolérance et l'exposition de STK-002 après injection intravitréenne à différentes doses ( https://clinicaltrials.eu/inn/stk-002) [ 200]. Les objectifs secondaires incluent des observations préliminaires sur l'efficacité, notamment l'amélioration de la fonction visuelle, de la structure oculaire et de la qualité de vie des patients.
Ces résultats prometteurs ont suggéré que la modulation de l'épissage du gène OPA1 par ASO pourrait restaurer une fonction protéique normale, offrant ainsi une approche thérapeutique universelle pour les pathologies rétiniennes et autres troubles visuels associés à la perte de fonction du gène OPA1 .
Recrutement des nucléases
Interférence ARN : exemple de la rhodopsine
Les ASO peuvent également être utilisés pour recruter des RNases, formant un hétéroduplex ARN-ADN et activant la RNase H1, qui dégrade l'ARN cible tout en préservant l'ADN (voir fig. 45-7
Fig. 45-7Mécanismes d'action des oligonucléotides antisens (ASO). La figure illustre les différentes étapes du cycle de l'ARNm où des ASO (représentés par des peignes rouges) peuvent agir pour moduler l'expression génique. 1. Moduler le capping : les ASO peuvent interférer avec la mise en place de la coiffe 5′ (m7G cap), affectant la stabilité et la traduction de l'ARNm. 2. Moduler la polyadénylation : les ASO peuvent cibler les signaux de polyadénylation en 3′, modifiant la stabilité de l'ARNm. 3. Dégrader l'ARNm : en se fixant sur l'ARNm, certains ASO peuvent permettre le recrutement de la RNase Het induire la dégradation de l'ARNm ciblé, réduisant l'expression protéique. 4-5. Moduler l'épissage : les ASO se fixent sur des séquences régulatrices d'épissage (ESE, ISE, ESS, ISS) pour empêcher ou favoriser la reconnaissance d'un exon. Cela peut conduire à son exclusion ou son inclusion, et donc à la production d'isoformes protéiques différentes à partir du même gène. 6. Inhiber la traduction : les ASO peuvent bloquer la progression du ribosome le long de l'ARNm, empêchant la synthèse de la protéine. Ainsi, les ASO constituent des outils puissants pour moduler la maturation, la stabilité et la traduction des ARNm, permettant de corriger ou d'inhiber l'expression de gènes dans un contexte thérapeutique.
Source : J.-M. Rozet.
) [108]. Ce mécanisme est hautement sensible aux mésappariements, lesquels peuvent réduire ou annuler son efficacité. C'est sur ce principe que repose cette thérapie, visant à dégrader sélectivement les transcrits mutants tout en préservant l'expression des allèles sauvages, ce qui permet de maintenir la fonction normale [139]. En pratique, atteindre une spécificité allélique complète reste un défi, comme le montrent les travaux précliniques sur le variant récurrent G56R du gène NR2E3 , responsable d'une rétinite pigmentaire [201]. Ces travaux, utilisant des gapmers – des ASO formant un hétéroduplex ARN-ADN et recrutant la RNase H1 – ont démontré le potentiel des ASO pour dégrader l'allèle mutant tout en soulignant les difficultés persistantes liées à l'obtention d'une spécificité complète, notamment la dégradation partielle de l'allèle non ciblé [201].
À ce jour, un seul variant a dépassé le stade préclinique dans le domaine des maladies rares ophtalmologiques : le variant c.68 C>A du gène de la rhodopsine, mieux connu sous sa forme protéique P23H (substitution de la proline 23 par une histidine; voir fig. 45-9
Fig. 45-9Thérapies par oligonucléotides antisens (ASO) en cours d'essai clinique. Pour chaque cible, sont représentés, de haut en bas : le gène et sa localisation chromosomique, l'ARN pré-messager (avec les sites consensus d'épissage aux jonctions intron-exon indiqués par des rectangles pleins et les sites cryptiques par des rectangles en pointillés, en bleu pour la situation normale et en rouge pour la situation pathologique), l'ARN messager et la protéine; et de droite à gauche la situation normale, pathologique (les variants sont symbolisés par une étoile rouge au niveau du gène et de son ARN pré-messager, et par un codon stop lorsqu'ils introduisent un codon de terminaison prématuré dans l'ARN messager) et l'effet attendu du traitement par ASO. Un seul allèle est représenté pour CEP290 et USH2A, dont les maladies associées sont de transmission autosomique récessive. En revanche, les deux allèles, normal et mutant, sont présentés pour RHO et OPA1, dont les variants sont responsables de maladies à transmission autosomique dominante. Dans le cas d'OPA1, le variant est représenté de façon arbitraire dans l'exon 5, mais l'approche TANGO vise des mécanismes d'épissage qui dépassent cet exon.
Source : J.-M. Rozet.
). La rhodopsine est la protéine membranaire des disques du segment externe des bâtonnets qui, associée au 11- cis- rétinal, confère aux photorécepteurs leur sensibilité à la lumière et leur capacité à initier la cascade de phototransduction. Les variants récessifs bialléliques de perte de fonction affectent principalement la phototransduction. Les variants dominants du gène RHO ont été classés en cinq catégories fonctionnelles selon leur impact sur le repliement, le transport et la fonction de la rhodopsine [202]. Le variant P23H appartient à la classe 2, caractérisée par un effet dominant négatif passant par un repliement anormal de la rhodopsine. Ces anomalies entraînent la rétention de la protéine dans le réticulum endoplasmique, la formation d'agrégats intracellulaires et l'activation de la réponse au mauvais repliement protéique (UPR), contribuant à la mort des photorécepteurs [ 203]. Cliniquement, elles se traduisent par une rétinopathie pigmentaire souvent sectorielle, avec une perte progressive de la vision nocturne et une conservation initiale de la fonction des cônes [ 202].
Le variant P23H est presque exclusivement retrouvé aux États-Unis, où il affecte entre 2000 et 3000 individus [204].
QR-1123 est un ASO de type gapmer , conçu pour cibler spécifiquement l'ARNm porteur du variant c.68 C>A (P23H). Il active RNase H1 pour induire sa dégradation sélective et prévenir la production de la forme toxique de la rhodopsine. Les études précliniques ont montré que QR-1123 réduit sélectivement l'expression de la rhodopsine humaine P23H in vitro dans des lignées cellulaires et in vivo chez des souris knock-in humanisées portant le gène humain muté P23H , produisant ainsi la protéine humaine mutée. L'injection intravitréenne de QR-1123 a également ralenti la dégénérescence des photorécepteurs, suggérant que ce gapmer pourrait constituer une thérapie efficace pour la rétinite pigmentaire autosomique dominante (adRP) due au variant P23H.
L'étude clinique de phase 1/2 AURORA (PQ-1123-001; NCT04123626), lancée en 2019, a inclus 27 à 35 adultes porteurs d'une RP autosomique dominante due au variant P23H. Chaque participant a reçu une injection intravitréenne unique de QR-1123 à des doses de 75, 150, 300 ou 450 μg. L'étude visait à évaluer la sécurité et la tolérabilité, ainsi que des paramètres fonctionnels (acuité visuelle, champ visuel) et structurels (OCT) sur 12 mois.
Le succès de cet essai offrirait une première voie thérapeutique ciblée pour les variants dominants de la rhodopsine, le gène le plus fréquemment impliqué dans les cas de RP autosomique dominante (20 % à 30 % des cas), cette forme représentant 15 % à 25 % de l'ensemble des cas de rétinopathie pigmentaire [202].
Discussion
Les ASO représentent une approche thérapeutique prometteuse pour le traitement des maladies génétiques ophtalmologiques. Leur capacité à cibler précisément des séquences spécifiques d'ARN offre une précision thérapeutique sans précédent, permettant de corriger des variants génétiques ou de moduler l'expression génique de manière ciblée. Cette spécificité, combinée avec leur flexibilité d'action à différents niveaux biologiques, en fait des outils adaptables pour traiter diverses dystrophies rétiniennes héréditaires et potentiellement des affections plus courantes comme la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) ou la rétinopathie diabétique.
Au-delà de la correction des variants génétiques, les ASO peuvent influencer des processus cellulaires fondamentaux en ciblant des ARN régulateurs, tels que les micro-ARN ou les ARN non codants. Cette modulation permet d'agir sur la prolifération cellulaire, l'apoptose et la réponse aux signaux environnementaux, offrant ainsi des perspectives thérapeutiques élargies. De plus, leur administration en ophtalmologie est relativement simple et modérément invasive, sans recours à des vecteurs viraux, ni à des adjuvants, ce qui facilite leur intégration dans la pratique clinique.
Cependant, plusieurs défis subsistent. La stabilité des ASO dans l'organisme demeure un enjeu majeur, car ils doivent résister à la dégradation enzymatique pour conserver leur efficacité. L'administration ciblée aux tissus oculaires, en particulier à travers la barrière hématorétinienne, reste complexe et nécessite des vecteurs ou des formulations innovantes pour améliorer la pénétration cellulaire. Par ailleurs, bien que les ASO soient conçus pour une haute spécificité, le risque d'effets hors cible n'est pas nul et pourrait entraîner des conséquences indésirables.
L'adaptation thérapeutique individuelle est un autre aspect crucial. La variabilité des profils génétiques entre les patients impose une personnalisation des traitements, nécessitant des tests de génotypage et de transcriptomique pour prédire la réponse aux ASO. En outre, des stratégies de libération contrôlée ou de traitements répétés doivent être développées pour garantir des effets durables, tout en minimisant la fréquence des injections.
Malgré ces défis, les avancées récentes en matière de chimie des oligonucléotides, de vecteurs de délivrance et de compréhension des mécanismes pathologiques renforcent le potentiel des thérapies antisens. Celles-ci ouvrent la voie à des traitements plus sûrs, plus efficaces et adaptés à une gamme étendue de maladies ophtalmologiques, marquant une étape décisive dans l'ophtalmogénétique.
À retenir
Avantages des thérapies antisens
Les oligonucléotides antisens (ASO) présentent plusieurs avantages notables par rapport aux autres approches thérapeutiques :
spécificité ciblée : les ASO peuvent être conçus pour cibler précisément des séquences spécifiques d'ADN ou d'ARN, offrant ainsi une précision thérapeutique sans affecter d'autres gènes ou processus biologiques;
flexibilité thérapeutique : leur capacité à agir à différents niveaux biologiques – que ce soit sur l'ADN, l'ARN ou la protéine – les rend utiles pour traiter une variété de mécanismes pathologiques;
possibilité d'intervention précoce : les ASO peuvent être administrés tôt dans la maladie, avant que des dommages irréversibles ne se produisent, ce qui peut permettre de limiter la progression de la maladie;
traitement des pertes et des gains de fonction pathologiques sans modification du génome;
conception simple entre modélisation et empirisme, appuyée par une chimie versatile au service des objectifs thérapeutiques;
mode d'administration de routine en ophtalmologie, modérément invasif, sans adjuvant, ni vecteur;
les avantages d'un effet non permanent mais néanmoins durable;
des bénéfices prolongés avec un nombre réduit d'injections.
Défis biologiques et techniques dans la mise en œuvre des thérapies antisens
Cependant, plusieurs défis doivent encore être surmontés pour maximiser leur efficacité et leur sécurité :
stabilité des ASO : les ASO doivent être conçus pour être suffisamment stables dans le corps afin de maintenir leur activité thérapeutique;
efficacité d'administration : la livraison ciblée des ASO dans les tissus oculaires reste un défi majeur. Des vecteurs et des formulations plus efficaces sont nécessaires pour garantir une pénétration adéquate dans les cellules rétiniennes;
effets hors cible : bien que les ASO soient très spécifiques, il existe un risque d'interactions avec des séquences non ciblées, ce qui pourrait entraîner des effets indésirables.
Les approches thérapeutiques antisens présentent des avantages considérables, mais elles doivent faire face à plusieurs défis avant de pouvoir être utilisées de manière clinique et à grande échelle. Ces défis incluent :
l'accès aux tissus cibles : l'un des plus grands défis pour les thérapies antisens dans le cadre des maladies génétiques ophtalmologiques réside dans l'administration efficace des ASO aux tissus oculaires. L'œil est une structure complexe et isolée, avec des barrières biologiques telles que la barrière hématorétinienne qui limitent l'accès des thérapeutiques aux structures internes de l'œil, en particulier les couches rétiniennes et le cristallin;
la stabilité et la durée d'action : une autre limitation est la stabilité des ASO dans l'organisme. Les ASO doivent être suffisamment stables pour résister à la dégradation avant d'atteindre leur cible. Les défis sont particulièrement importants dans les traitements à long terme, où des stratégies de délivrance répétée ou de libération contrôlée sont nécessaires;
la sélection et la spécificité : l'efficacité et la spécificité des ASO sont essentielles pour éviter des effets indésirables ou des effets hors cible. Des études approfondies sont nécessaires pour assurer que les ASO n'interfèrent pas avec d'autres processus biologiques, notamment dans le cas des tissus oculaires où des altérations peuvent conduire à des effets secondaires graves;
la réponse individuelle et l'adaptation thérapeutique : chaque individu présente un profil génétique unique, ce qui implique que des traitements personnalisés seront nécessaires. Des tests de génotypage et de transcriptomique seront donc essentiels pour prédire la réponse à ces thérapies.
V. Apport d'une molécule thérapeutique
De la thérapie optogénétique à la thérapie sonogénétique
S. Picaud, D. Dalkara, J.-A. Sahel
Introduction
L'optogénétique est une technique récente permettant de contrôler l'activité neuronale en réponse à la lumière grâce à l'introduction de protéines photosensibles dans les cellules ciblées [205-206-207]. Ce concept repose sur la découverte de gènes codant pour des protéines photosensibles, notamment la channelrhodopsine (ChR) [208-209-210], mais aussi l'halorhodopsine [ 211] ou l'archaerhodopsine (Arch) [ 212].
Dans un premier temps, l'optogénétique a été conceptualisée avec la channelrhodopsine 2 (ChR2) qui est une opsine canal cationique. Ainsi, son expression dans un neurone permet de produire une dépolarisation cellulaire pouvant généralement conduire à des potentiels d'action [ 205 , 206]. Cependant, l'arsenal des protéines photosensibles utilisées en optogénétique s'est rapidement étendu, notamment vers des transporteurs d'ions, en particulier d'ions chlorure qui vont inversement conduire à une hyperpolarisation ou inactivation des neurones comme l'halorhodopsine [213-214-215-216]. L'inhibition des neurones a également été proposée par des pompes à proton H + [ 217]. Parallèlement, des opsines comme la mélanopsine ou les opsines des photorécepteurs ont également été exprimées dans des neurones afin d'activer des protéines G naturelles des cellules hôte [ 206 , 218-219-220-221]. En effet, ces neurones n'expriment pas le partenaire habituel des opsines de mammifères, la transducine; par conséquent, une autre protéine G doit être recrutée pour médier l'effet physiologique escompté.
Depuis les débuts de la thérapie optogénétique, une recherche génétique notamment dans les différentes familles d'algues unicellulaires a permis de diversifier les protéines photosensibles non seulement dans la nature de leur conductance ionique [222-223-224-225], mais aussi dans la gamme de leur sensibilité spectrale [210 , 226-227-228]. En parallèle, différentes équipes se mirent à manipuler la structure des protéines naturelles pour construire de novo de nouvelles protéines photosensibles. C'est ainsi que différents récepteurs ionotropiques furent rendus photosensibles soit par une partie d'opsine naturelle [229], soit par addition d'un photoswitch chimique non naturel [ 230 , 231]. D'autres canaux photosensibles furent également produits par fusion de canaux ioniques à d'autres protéines naturellement photosensibles [232].
Pour une application clinique, la stimulation optogénétique de la rétine devenue aveugle semble l'application de choix, car l'œil offre une fenêtre optique sur le tissu rétinien. Une telle restauration visuelle a été récemment réalisée avec succès chez un patient aveugle atteint de rétinopathie pigmentaire [233]. Ce sous-chapitre décrit les étapes qui ont permis cette première mondiale, mais aussi toutes les alternatives possibles pour améliorer les performances des patients.
Dans la continuité de cette première partie sur la restauration visuelle optogénétique au niveau de la rétine, nous introduisons également les approches développées pour la restauration visuelle au niveau cortical soit par thérapie optogénétique, soit par thérapie sonogénétique. La thérapie sonogénétique repose sur l'expression de protéines mécanosensibles dans les neurones pour les sensibiliser aux ondes ultrasonores [234 , 235]. Si certaines cellules sont naturellement mecanosensibles, leur modulation ultrasonore nécessite une énergie acoustique proche des seuils toxiques [236]. C'est pourquoi l'expression ectopique de canaux ioniques ou autres protéines mécanosensibles peut très significativement réduire cette pression acoustique et limiter le risque de lésions des tissus [ 235 , 237]. Dans une étude préliminaire sur les rongeurs, nous avons fait la preuve de concept que la thérapie sonogénétique procurait la résolution temporelle et spatiale pour une restauration visuelle de qualité au niveau cortical [238]. Ce sous-chapitre introduit donc dans sa deuxième partie la restauration visuelle au niveau cortical avec les travaux en cours par thérapie optogénétique ou thérapie sonogénétique. Ces deux formes de thérapie innovante offrent de grands espoirs pour restaurer une vision utile chez de très nombreuses personnes devenues aveugles.
Restauration visuelle optogénétique au niveau rétinien
Au cours des deux dernières décennies, les prothèses rétiniennes pour restaurer la vision de patients aveugles ont fait d'énormes progrès, passant de la simple perception de la lumière à la possibilité de lire des mots voire des phrases [239-240-241]. Si les prothèses Argus II® de l'entreprise Second Sight et celles Alpha AMS® de l'entreprise Retina Implant AG ont été retirées du marché [242], la prothèse rétinienne PRIMA® ( Pixium vision now science corp ) offre aujourd'hui la meilleure acuité visuelle restaurée chez les patients devenus aveugles [241]. Cette prothèse rétinienne a été testée chez des patients atteints de dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) de forme atrophique résultant en une acuité visuelle prothétique comprise entre 20/460 et 20/565, avec la capacité de fusionner la vision artificielle infrarouge centrale et la vision périphérique naturelle. Malgré les améliorations potentielles de cette technologie [ 243], il devrait être difficile d'atteindre une résolution cellulaire. La thérapie optogénétique offre la perspective d'atteindre cet objectif de résolution cellulaire, même si de nombreux obstacles doivent préalablement être résolus.
Ciblage des cellules ganglionnaires rétiniennes
L'équipe de Zhao Pan à Détroit (États-Unis) fut la première à proposer cette alternative de restauration visuelle [ 244]. Pour cela, la channelrhodopsine 2 (ChR2) fut exprimée dans les cellules ganglionnaires rétiniennes de la souris rd1, un modèle classique de rétinopathie pigmentaire, après la perte complète de ses photorécepteurs. Si, au stade choisi, les cellules ganglionnaires de la rétine non transfectée ne répondent pas à une stimulation lumineuse, les rétines exprimant ChR2 dans les cellules ganglionnaires montrent de très belles réponses à la lumière. La fréquence de décharge de potentiels d'action est fonction de l'intensité lumineuse appliquée sur la rétine [ 244].
Ce premier résultat fut ensuite confirmé par une autre équipe sur des rats dystrophiques aveugles de type Royal College of Surgeons (RCS) [ 245 , 246]. Dans une visée translationnelle, l'expression de ChR2 fut obtenue avec succès dans la rétine d'un primate non humain, le marmouset [247]. Ce travail ne fit pas l'objet d'une quantification fonctionnelle des cellules exprimant ChR2. Néanmoins, il fut mis à profit par l'entreprise Retrosense pour évaluer la restauration visuelle par expression de ChR2 dans un essai clinique lancé en 2015 (NCT02556736). Malheureusement, aucun résultat ne fut publié sur cette étude clinique, suggérant l'absence de restauration visuelle chez les patients.
Le Pr Zhao Pan est à ce jour conseiller scientifique d'une nouvelle entreprise, Ray Therapeutic, qui cible son produit de thérapie optogénétique RTx-015 vers les cellules ganglionnaires de la rétine. Ce produit, dont l'opsine n'est pas explicite sur le site de l'entreprise, est déjà en phase clinique (NCT06460844) pour les patients atteints de rétinopathie pigmentaire ou de choroïdérémie.
Suite à ces résultats ouvrant des perspectives prometteuses, plusieurs équipes académiques se mirent à développer des projets parallèles exprimant de nouvelles opsines dans les cellules ganglionnaires. Dans ce contexte, la mélanopsine fut par exemple exprimée dans toutes les cellules ganglionnaires de la rétine [218]. Chez les mammifères, la mélanospine est naturellement exprimée dans un sous-type de cellules ganglionnaires (1–3 %) intrinsèquement sensibles à la lumière dont le rôle non-visuel contribue à la régulation des rythmes circadiens [248-249-250]. Si l'expression ectopique de cette opsine permet d'activer très efficacement toutes les cellules ganglionnaires, la durée d'activation est malheureusement soutenue sur plusieurs minutes [218], ce qui ne s'avère pas compatible avec la perception dynamique nécessaire au cours de la locomotion. Des opsines dont l'inactivation est plus rapide, comme celle des bâtonnets ou celle des cônes, furent aussi exprimées dans les cellules ganglionnaires de la rétine [ 219 , 221].
L'intérêt de cette stratégie repose sur la bien plus grande sensibilité de ces opsines dans des gammes de lumière plus compatibles avec la vie courante que la majeure partie des opsines microbiennes qui ne disposent pas d'un processus d'amplification comme pour les opsines humaines, mais sont directement couplées à une conductance ionique. L'expression ectopique de l'opsine de cônes était à l'origine de la société Vedere Bio créée en 2021, puis achetée par Novartis. Cependant, les résultats précliniques ne furent pas à la hauteur des attentes pour poursuivre le projet par un essai clinique.
Dans la continuité des travaux de Zhao Pan avec ChR2, nous avons recherché des opsines microbiennes pouvant augmenter l'efficacité des réponses enregistrées dans les cellules ganglionnaires. C'est pourquoi, suite à la découverte d'une opsine microbienne ultra-sensible, CatCh [251], nous l'avons exprimée avec succès dans les cellules ganglionnaires de souris, puis de primates non humains [252]. L'utilisation d'un promoteur spécifique des cellules ganglionnaires devant le gène de l'opsine nous a permis d'en augmenter l'expression dans ces cellules et donc l'efficacité de leur activation [ 252]. Sur les primates, l'expression de l'opsine se trouvait concentrée dans un anneau maculaire en accord avec l'exclusion des cellules ganglionnaires de la zone fovéolaire. Cette observation est en accord avec la plus grande facilité de transfecter les cellules rétiniennes dans la zone maculaire après une injection vitréenne de vecteurs viraux AAV [253]. L'enregistrement de l'activité de ces cellules ganglionnaires transfectées sur des matrices d'électrodes permettait de mesurer la gamme de sensibilité à la lumière et de quantifier les cellules ganglionnaires enregistrées devenues photosensibles [252]. L'analyse de ces données électrophysiologiques conduit à l'estimation de l'acuité visuelle théorique à 20/72 pour cette forme de thérapie optogénétique [ 254].
Cependant, l'opsine CatCh est sensible dans la gamme de lumière bleue à des intensités lumineuses proches du seuil de toxicité admis; le choix a donc été fait de sélectionner une opsine sensible dans la gamme de lumière rouge. En effet, si la lumière bleue est toxique pour les cellules, très certainement par l'activation de photosensibilisants dans leurs mitochondries, la lumière rouge ne montre pas la même toxicité [255] et peut donc être utilisée sans risque à de plus fortes luminances. C'est pourquoi nous avons testé l'efficacité de deux opsines sensibles dans le spectre lumineux rouge, ReachR [ 256] et ChrimsonR [ 257]. Dans les deux cas, l'activation des cellules ganglionnaires rétiniennes a pu être obtenue par l'expression de ces opsines [ 258 , 259]. Le choix s'est porté sur Chrimson qui était, au moment du choix, la protéine dont la sensibilité était aux plus hautes longueurs d'onde dans le rouge [ 257], fusionnée avec un gène rapporteur fluorescent rouge ChrimsonR-tdTomato, et nous avons sélectionné le vecteur viral AAV2-7m8 pour optimiser son expression chez les primates [257].
Dans une approche translationnelle, cette opsine a été exprimée dans les cellules ganglionnaires de primates non humains pour s'assurer de l'absence de réaction inflammatoire majeure à l'expression d'une protéine d'algue dans une cellule de primate. En effet, Chrimson est un canal ionique dont une partie se retrouve à la surface des cellules ganglionnaires. Par conséquent, les cellules ganglionnaires se retrouvent décorées à leur surface par une protéine d'algue, situation qui pourrait conduire à une réaction inflammatoire de rejet. Heureusement, aucune réaction inflammatoire n'a été notée chez le primate non humain, si ce n'est la réaction transitoire à l'injection du vecteur viral [ 259].
Cette étude préclinique posait également la question du meilleur choix pour la protéine et le meilleur vecteur viral. En effet, toutes les études sur l'animal avaient tendance à utiliser la protéine Chrimson fusionnée à une protéine fluorescente tdTomato, car cette dernière permet de visualiser les cellules exprimant l'opsine Chrimson-tdTomato [257]. Il fallait donc déterminer si la fusion avec tdTomato avait un impact sur l'expression de la protéine. Le résultat étonnant est que la fusion avec la protéine tdTomato augmente l'expression de l'opsine Chrimson [259].
Enfin, l'évolution dirigée de vecteurs viraux avait montré une augmentation d'expression de la protéine fluorescente de type GFP dans les cellules rétiniennes avec le vecteur viral muté AAV2-7m8. Il fallait donc vérifier que ce variant 7m8 augmentait également l'expression de l'opsine Chrimson-tdTomato. L'efficacité du vecteur AAV2-7m8 s'est traduite par une augmentation très significative de l'expression de l'opsine et donc un plus grand nombre de cellules ganglionnaires enregistrées répondant à une stimulation lumineuse rouge, même en présence du cocktail de bloqueurs synaptiques [ 259]. Une équipe américaine a aussi validé l'efficacité de Chrimson pour l'activation in vivo des cellules ganglionnaires rétiniennes in vivo dans une zone dépourvue de photorécepteurs du primate non humain [ 260]. Il a même été possible de montrer que l'activation de Chrimson dans les cellules ganglionnaires se propage jusqu'aux neurones du cortex visuel [261].
L'ensemble de ces travaux précliniques ont abouti à un essai clinique (NCT03326336) par la société française GenSight Biologics. Le produit GS030 qui est injecté en intravitréen chez les patients aveugles atteints de rétinopathie pigmentaire correspond au vecteur AAV2-7m8 codant pour la protéine fusionnée Chrimson-tdTomato, ce vecteur ayant cette fois été produit à un grade clinique [ 233]. Dans cet essai clinique, des patients aveugles ont retrouvé une vision utile leur permettant de compter et saisir des objets [ 233]. Pour cela, ils doivent porter des lunettes qui convertissent la scène visuelle en une stimulation monochrome à 600 nm. La caméra qui équipe ces lunettes est un capteur asynchrone, qui pourrait permettre le codage à la milliseconde des cellules ganglionnaires de la rétine [ 262]. Cet essai clinique représente une première mondiale pour l'application fonctionnelle de la thérapie optogénétique chez des patients, avec une efficacité de l'opsine pour moduler l'activité neuronale et, dans ce cas, pour restaurer une perception visuelle.
Parallèlement à cette étude, la société Bionic Sight LLC a développé une approche alternative fondée sur l'expression de l'opsine Chronos [ 257] dans les cellules ganglionnaires [ 263]. L'essai clinique (NCT04278131) repose sur une étude préclinique montrant une efficacité dose-dépendante du vecteur viral chez la souris aveugle et la non-toxicité chez le primate [263]. Ces travaux précliniques ne procurent aucune information sur l'expression de l'opsine dans la rétine du primate, ni sur son efficacité dans l'activation de ses cellules ganglionnaires rétiniennes. Pour cette approche, un convertisseur d'images spécifique a été proposé [264]. Le recrutement des patients dans cet essai clinique (NCT04278131) devrait être atteint dans le courant de l'année 2026 avec une finalisation de l'étude pour la fin 2029.
Ciblage des cellules bipolaires
Peu après les travaux de Zhao Pan ciblant les cellules ganglionnaires [49], le laboratoire de Botond Roska à Bâle cibla ChR2 dans les cellules bipolaires de type ON, car cela permettait de bénéficier du traitement de l'information visuelle par le circuit rétinien résiduel et ainsi de retrouver l'organisation centre-pourtour des champs récepteurs des cellules ganglionnaires [265]. Ce résultat original fut confirmé avec des innovations en termes de vecteur et de promoteur [ 266]. Nous avons également pu montrer que ce ciblage des cellules bipolaires ON permet de restaurer les réponses ON et OFF dans les cellules ganglionnaires [267].
La difficulté de cibler les cellules bipolaires chez les animaux de grande taille peut expliquer le manque de projet clinique avec cette cible cellulaire. La société Nanoscope Therapeutics développe néanmoins un tel projet d'optogénétique, dont l'opsine propriétaire ( multi-caracteristic opsin [MCO1]) de très large bande spectrale repose sur une combinaison des opsines ChR2, ReaCh et C1V1 [ 268]. Cette opsine a été ciblée dans les cellules bipolaires ON par un activateur de promoteur du récepteur métabotropique mGluR6 spécifique des cellules bipolaires ON , comme le montrent des images chez la souris rd1 [269]. L'injection intravitréenne du vecteur viral aboutit à la restauration visuelle chez des souris rd1 et rd10, deux modèles animaux de rétinopathie pigmentaire [269], et chez la souris rd12, un modèle d'amaurose congénitale de Leber [ 270]. De plus, l'expression de l'opsine induit un effet neuroprotecteur sur les cellules rétiniennes de ces souris dystrophiques [ 269].
Ces résultats précliniques ont abouti à un essai clinique sur des patients atteints de rétinopathie pigmentaire avec des variants sur le gène ABCA4 qui présentent une amélioration de leur vision et de la perception des formes [271]. Une lettre à l'éditeur du journal questionne cependant le fonctionnement de l'opsine et le design de l'étude clinique avec une sélection de patients très particuliers et un risque d'habituation aux tests comportementaux qui pourrait expliquer l'effet thérapeutique dans l'œil non injecté [272]. L'entreprise a répondu sur la sélection de patients qu'ils ne possédaient plus de photorécepteurs détectables sur les images OCT et sur le fait que le vecteur thérapeutique pourrait être transféré dans l'œil controlatéral, expliquant l'effet thérapeutique dans cet œil non injecté [273].
Ciblage des cônes « dormants»
Botond Roska et son équipe ont constaté que des photorécepteurs à cônes persistent très longtemps dans la rétine des souris rd1, ce modèle classique de rétinopathie pigmentaire, mais que ces cônes résiduels perdent leur sensibilité à la lumière. Nos études cliniques montrent que de nombreux patients devenus aveugles conservent également de tels cônes dit « dormants». Botond Roska et son équipe proposèrent donc de les réactiver avec une opsine produisant une hyperpolarisation des neurones, l'halorhodopsine [215 , 274]. Cette pompe à protons ou ions chlorure [ 211 , 275] pourrait ainsi hyperpolariser les cônes dormants sous l'effet de la lumière, restituant ainsi leur fonction visuelle naturelle.
L'expression de l'halorhodopsine dans les cônes dormants de souris dystrophiques permit de restaurer non seulement leur fonction visuelle, mais également des fonctions visuelles de la rétine aussi complexes que la détection directionnelle du mouvement [216]. L'expression de l'halorhodopsine dans les photorécepteurs humains sur des rétines humaines post mortem en culture permit également de leur redonner une sensibilité à la lumière [ 216]. Dans une perspective translationnelle, l'expression de l'halorhodopsine fut évaluée dans les cônes de primate non humain, ce qui entraîna des difficultés de production à la membrane de la protéine dans les cônes in vivo. Cette difficulté fut ultérieurement résolue par l'utilisation d'une autre pompe ionique, Jaws [ 276]. Dans cet article, le design d'un nouveau vecteur viral permit de cibler les cônes fovéolaires par une simple injection sous-rétinienne périphérique et donc sans décollement de la macula. Récemment, Botond Roska a créé l'entreprise RhyGaze AG pour traduire cette stratégie optogénétique en clinique.
Restauration visuelle au niveau cortical
Pour les maladies conduisant à la cécité provoquée par la perte du nerf optique, des prothèses visuelles corticales ont été développées dans les années 1960 par Brindley et Lewin permettant la lecture du braille [277-278-279]. Cependant, chez de nombreux patients, cette vue retrouvée finit par s'estomper. Plus récemment, la prothèse corticale Orion® de la société Second Sight a montré une reconnaissance de forme après stimulation séquentielle du cortex visuel avec des électrodes de surface (500 μm) espacées tous les 2 mm [280]. Des études parallèle sur le primate ont montré que l'activation du cortex visuel dans sa profondeur requiert des courants bien plus faibles que la stimulation de surface [ 281]. Ainsi, les électrodes pénétrantes Utah ont permis aux primates de reconnaître les lettres de manière bien plus dynamique [ 282], résultats confirmés aussi chez des patients aveugles [283]. Cependant, ces électrodes pénétrantes perdent leur efficacité de stimulation avec le temps [ 284] et, surtout, elles induisent une fibrose réactionnelle détruisant le cortex visuel [285]. C'est pourquoi, dans les essais cliniques, ces électrodes Utah arrays sont retirées après 6 mois d'implantation [283].
Thérapie optogénétique
La thérapie optogénétique est apparue comme une alternative évidente sans contact pour l'activation à distance des neurones corticaux depuis la surface du cerveau. L'expression d'une opsine microbienne dans le cortex visuel permet d'activer efficacement les neurones corticaux depuis la surface du cerveau [286-287-288]. Chez le primate non humain, cette activation corticale peut même induire des saccades visuelles vers le point correspondant dans le champ visuel et produire une activation des zones connectées au cortex [ 286 , 287 , 289]. Des changements plus subtils ont été décrits, comme une sensibilité accrue à l'orientation du stimulus, constatée uniquement lorsque la stimulation optogénétique a été appliquée sur une colonne avec une sélectivité d'orientation proche de celle du stimulus [290 , 291]. De plus, l'activation optogénétique de colonnes à dominance oculaire unique a généré une activation préférentielle des colonnes proches du même œil [95]. L'inhibition neuronale utilisant l'opsine ArchT a conduit à la suppression partielle des réponses évoquées visuellement et a modifié les courbes psychométriques associées à la discrimination des stimuli visuels en fonction de leur luminance [292]. Encore une fois, les courbes psychométriques ont été modifiées uniquement lorsque l'emplacement des stimuli visuels correspondait au champ de réception de la stimulation.
Pour une application clinique, la stimulation lumineuse dans la profondeur du cortex s'avère difficile du fait de l'absorption et de la diffusion de la lumière dans le tissu cérébral [293]. Cette difficulté explique la faible utilisation de l'optogénétique dans l'analyse du fonctionnement du cerveau de primate par rapport à son application généralisée chez les rongeurs [ 294]. Une autre difficulté liée à la restauration visuelle tient en la nécessité de produire au moins 600 pixels distincts pour la locomotion, la reconnaissance faciale ou la lecture de texte [ 295 , 296]. Pour résoudre cette difficulté, une étude pionnière a utilisé un réseau de LED implanté de manière chronique à la surface du cortex du primate non humain [ 292]. Pour mieux cibler la profondeur du cortex visuel, d'autres équipes proposent d'associer à de telle matrice de LED des guides optiques pénétrant dans le cortex visuel [297-298-299-300]. Cependant, ces dispositifs optiques deviennent à nouveau très invasifs, perdant ainsi les promesses de l'optogénétique pour l'activation à distance et sans contact du cerveau.
La découverte de nouvelles opsines sensibles dans le rouge lointain voire l'infrarouge pourrait permettre de résoudre en partie ce problème, comme le montre la stimulation sur le rongeur à travers le crâne [ 301].
Thérapie sonogénétique
Dans une étude récente [ 238], nous avons proposé d'utiliser des ondes ultrasonores à la place de la lumière pour activer les neurones corticaux suite à l'expression ciblée d'un canal ionique mécanosensible. Cette stratégie d'activation ultrasonore des neurones a été baptisée sonogénétique , car elle repose sur l'expression génétique d'une protéine mécanosensible couplée à la stimulation ultrasonore. Il est bien connu que les ondes ultrasonores se propagent dans la profondeur des tissus et même profondément dans le cortex visuel des primates non humains, comme cela a été démontré dans notre étude par imagerie fonctionnelle ultrasonore du cortex visuel [302].
Certains neurones peuvent être naturellement sensibles aux ondes ultrasonores et aux ultrasons et la neuromodulation a été développée par différents laboratoires [303-304-305-306-307]. Cette sensibilité aux ultrasons semble reposer sur différentes protéines de la famille des canaux potassiques à deux domaines exprimés dans les neurones, à savoir le canal ionique MEC-4 chez Caenorhabditis elegans [308] et le canal ionique mécanosensible Piezo1 [309]. Malheureusement, ces stimulations ultrasonores peuvent générer des périodes réfractaires [307] et des hémorragies dues aux énergies ultrasonores élevées requises [ 236]. Pour réduire ces effets indésirables, diverses protéines ont été exprimées de manière ectopique dans les neurones pour les rendre sensibles aux ultrasons. Ces protéines sensibles aux ultrasons comprennent la protéine prestine à détection auditive [310 , 311], le canal ionique TRP-4 [ 312], le canal ionique TRPV1 [ 313] et le canal ionique à grande conductance mécanosensible MscL [314 , 315].
Toutes les études in vivo utilisant ces protéines ont montré une résolution temporelle nécessitant plusieurs centaines de millisecondes à une seconde pour développer la réponse, ce qui est trop lent pour la restauration visuelle [ 310 , 311 , 313 , 316]. Nous avons donc étudié si une protéine mécanosensible pouvait générer une activation sonogénétique avec une résolution spatiotemporelle compatible avec la restauration visuelle. Nous avons montré que la version mutée G22S du canal ionique MscL affichant une sensibilité accrue à la stimulation ultrasonore peut être exprimée de manière fiable dans les neurones du cortex visuel, fournissant une résolution temporelle de la milliseconde et une résolution spatiale de l'ordre de 100 μm lors de l'application d'ondes ultrasonores de 15 MHz en toute sécurité [238]. Nous avons également observé dans un test comportemental que l'activation sonogénétique ultrasonore du cortex visuel est perçue comme un flash lumineux [ 238]. Ces résultats originaux fournissent la première preuve que la thérapie sonogénétique pourrait fournir une stratégie sûre pour restaurer la vue partielle chez les patients aveugles suite à une atrophie optique dans des maladies comme le glaucome ou la rétinopathie diabétique.
La thérapie sonogénétique peut ainsi devenir une interface cerveau-machine pour restaurer la vision et d'autres applications neuronales avec une stimulation de la structure cérébrale profonde à distance réalisée sans contact à partir d'un dispositif placé au-dessus de la dure-mère après une injection locale d'AAV fondé sur un promoteur cellulaire spécifique pour cibler l'expression de MscL dans une population neuronale sélectionnée. Ce dispositif nécessiterait également un convertisseur de scènes visuelles devant le patient en stimulations ultrasonores sur son cortex visuel.
Conclusion
Les stratégies génomiques fondées sur la thérapie génique exprimant de façon ectopique des canaux ioniques photosensibles ou mécanosensibles peuvent fournir des interfaces cerveau-machine à haute résolution. L'optogénétique est déjà en cours d'essais cliniques avec des résultats démontrant une vision partielle restaurée chez les patients atteints de rétinopathie pigmentaire. Des analyses supplémentaires sont nécessaires pour évaluer si les patients peuvent atteindre l'acuité visuelle théorique (20/72) estimée dans des études ex vivo sur la rétine de primate non humain. Les résultats des essais cliniques en cours permettront ainsi de déterminer si l'optogénétique peut constituer une alternative convaincante aux prothèses rétiniennes pour restaurer la vision.
De même, la thérapie sonogénétique offre une alternative aux prothèses corticales pour une stimulation corticale profonde sans contact au-dessus de la dure-mère. D'autres études sont nécessaires pour démontrer la perception de formes et évaluer la sécurité de cette stratégie avant de lancer des essais cliniques. Malgré ces limites actuelles, les résultats de notre étude suggèrent que la sonogénétique recèle de grands espoirs dans une nouvelle génération d'interfaces cerveau-machine pour la restauration visuelle corticale et d'autres applications neurologiques.
Les dystrophies rétiniennes : neuroprotection
N. Ait-Ali, K. Marazova, T. Léveillard, J.-A. Sahel
Introduction
Les dystrophies rétiniennes héréditaires sont des maladies rares dégénératives de la rétine d'origine génétique. Elles présentent une très grande hétérogénéité clinique et génétique, avec plus de 300 gènes cartographiés et/ou identifiés affectant plus de 4 millions de personnes dans le monde. La rétinopathie pigmentaire (RP), appelée dystrophie de type bâtonnet-cône (voir chapitre 9 ), constitue la forme la plus fréquente des dégénérescences rétiniennes héréditaires. Elles touchent une personne sur 4000 à 5000 dans la population générale, peuvent débuter à n'importe quel âge avec une fréquence d'apparition plus grande entre 10 et 30 ans, et se caractérisent par une perte progressive et graduelle de la vision en une à trois décennies.
Les options thérapeutiques pour les dystrophies rétiniennes sont actuellement limitées. Il n'existe en effet qu'une seule thérapie de remplacement de gène pour une des causes de dystrophies rétiniennes à début précoce liée à des variants bialléliques du gène RPE65 . Les progrès récents dans la compréhension des mécanismes de dégénérescence rétinienne ainsi que les progrès technologiques ont ouvert la voie à de nouvelles thérapies. Les deux dernières décennies ont été marquées par de nombreux développements permettant le passage de la découverte du gène à la thérapie génique. Cependant, l'hétérogénéité génétique des dystrophies rétiniennes et le caractère souvent tardif du diagnostic représentent des défis importants pour le développement de la thérapie génique. Les approches indépendantes du gène causal qui peuvent cibler des mécanismes biologiques sous-jacents communs de la maladie, comme l'utilisation de facteurs neuroprotecteurs ou d'inhibiteurs des facteurs du stress oxydatif ou de l'inflammation, peuvent améliorer la survie des cellules rétiniennes tout en permettant de traiter un large groupe de patients, même si la cause génétique reste non corrigée.
Rétinopathie pigmentaire (RP)
Les dégénérescences rétiniennes héréditaires se traduisent par la perte de fonction des photorécepteurs de la rétine. Les variants individuels dans les 75 gènes identifiés qui induisent la RP sont de toute nature [317]. Ces gènes mutés peuvent coder pour des protéines exprimées par les bâtonnets ou les cônes, ou les deux types de photorécepteurs.
La RP se caractérise en clinique par la perte des cônes précédée par la dégénérescence des bâtonnets. Elle se développe en deux étapes successives et progressives. Dès la fin de l'adolescence, la mort des photorécepteurs à bâtonnets par apoptose se traduit par une altération de la vision scotopique. Cela implique dans un premier temps un handicap visuel d'intensité variable, sans impacter considérablement la qualité de vie. C'est pourquoi les personnes vivant dans un environnement très éclairé tel qu'en ville ne se rendent compte des premiers symptômes de la RP que lorsque la maladie a déjà progressé. La perte de la vision « nocturne» est alors accompagnée d'un rétrécissement du champ visuel en périphérie, même en ambiance photopique, en raison de la dégénérescence progressive des cônes périphériques, dans un mouvement centripète. La phase suivante correspond à la dégénérescence des photorécepteurs à cônes centraux. Ceux-ci assurent non seulement la vision en couleur, mais aussi la vision à contraste élevé, l'acuité visuelle et toutes les fonctions visuelles en atmosphère lumineuse. La perte de leur fonction conduit à un handicap visuel majeur.
Métabolisme de la rétine
La choroïde est la seule source d'oxygène pour les rétines des cobayes, des lapins et des salamandres, qui sont très fines. Les primates, les rats et les souris ont des rétines plus épaisses avec des vaisseaux sanguins qui la traversent. Néanmoins, chez presque toutes les espèces examinées, les quantités d'oxygène mesurées sont très faibles dans une grande partie de la rétine, en particulier dans la couche des photorécepteurs [318 , 319]. L'EPR et la rétine semblent consommer la majeure partie de l'oxygène qui diffuse depuis la choroïde. Chez les mammifères comme le porc, la rétine a une activité métabolique importante et favorise la glycolyse [ 320]. La consommation d'oxygène et de glucose dans la rétine externe où sont localisés les photorécepteurs est réduite en présence de lumière par rapport à la consommation dans l'obscurité, et la majeure partie du glucose consommé est métabolisée en lactate à la fois à la lumière et dans l'obscurité. Le glucose destiné à la rétine provient du sang choroïdien et doit donc traverser la membrane de Bruch, puis l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) avant d'atteindre la rétine. Le glucose se déplace librement à travers les surfaces basales et apicales de l'EPR grâce à d'abondants transporteurs du glucose tels que GLUT1 [321].
Métabolisme de l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR)
Les cellules de l'EPR minimisent leur propre consommation de glucose, probablement pour maximiser le passage du glucose du sang choroïdien à travers l'EPR jusqu'à la rétine. Chez la souris, l'EPR convertit le glucose en lactate environ 20 fois plus lentement que la rétine [322]. Toutefois, pour compenser son besoin de « carburant» pour fonctionner, l'EPR utilise d'abondantes mitochondries ainsi que de nombreux nutriments sanguins et de sous-produits métaboliques partiellement oxydés provenant de la rétine [ 323]. Chaque jour, les cellules de l'EPR phagocytent les segments externes des bâtonnets qui sont chargés de protéines et de phospholipides [ 322], récupérant ainsi des acides gras. De plus, 70 % du glucose dans les cellules de l'EPR en culture sont stockés sous forme de glycogène. Lorsque le glucose dans le milieu s'épuise, le glycogène se décompose soit par phosphorolyse, soit par l'action des lysosomes [324].
Existence d'un écosystème métabolique entre la rétine et l'EPR dans l'œil
La dégénérescence des bâtonnets précède celle des cônes. L'altération du métabolisme dans les bâtonnets perturbe aussi l'EPR via l'AMP kinase (AMPK). L'absence d'expression de l'AMPK, un capteur d'énergie intracellulaire qui influence l'expression des enzymes métaboliques dans les photorécepteurs à bâtonnets, ralentit le flux métabolique de ces cellules. Cela entraîne une accumulation des vacuoles, des gouttelettes de lipides et du matériel des segments externes non digéré dans l'EPR [ 325].
Thérapies fondées sur le métabolisme
Il est bien établi que, dans la RP, les bâtonnets dégénèrent en raison de variants génétiques et beaucoup sont exprimés dans les bâtonnets. Les cônes dans la RP, qui généralement n'expriment pas les gènes de la maladie, dégénèrent cependant après les bâtonnets.
Facteur trophique RdCVF
Notre équipe a été parmi les premières à travailler sur les mécanismes qui sous-tendent la perte secondaire des cônes, responsables de la disparition tardive de la vision centrale, donc de la cécité. Nous avons émis plusieurs hypothèses et nous en avons validé deux : celle d'une neurotoxicité initiale lors de la dégénérescence des bâtonnets, et surtout celle d'une dépendance trophique des cônes sur les bâtonnets. Le lien entre la perte des bâtonnets suivie de la perte des cônes a été étudié sur la souris rd1 , un modèle proche de certaines formes de la RP humaines. La transplantation de bâtonnets préparés en couche pure au vibratome a été réalisée à un âge de 5 semaines (où l'ensemble des bâtonnets a déjà dégénéré, et où les cônes ont seulement entrepris leur processus de dégénérescence). Nous avons démontré que la transplantation ralentit de moitié la dégénérescence des cônes [ 326 , 327]. Cet effet trophique, constaté à distance du transplant, suggérait l'existence de facteurs diffusibles libérés par les cellules greffées [328].
Pour caractériser la ou les molécules qui assurent la viabilité des cônes, nous avons développé une approche systématique par clonage par expression fondée sur un test de viabilité des cônes. Nous avons montré que, dans une culture de cellules rétiniennes d'embryons de poulet cultivées à faible densité et en l'absence d'agents inducteurs (qui conduit à une différenciation en photorécepteurs qui sont majoritairement des cônes), la dégénérescence est ralentie lorsque ces cultures sont réalisées en présence de milieu préparé à partir d'explants rétiniens de souris normales. Nous avons conclu qu'une molécule synthétisée et sécrétée par les rétines de souris est capable d'induire une survie des cônes de poulet. À partir de la construction d'une banque d'expression de rétine de souris, nous avons isolé un clone correspondant à une nouvelle protéine de 109 acides aminés, non précédemment répertoriée dans les facteurs de croissance. Nous avons nommé cette protéine rod-derived cone viability factor (RdCVF) [329 , 330].
RdCVF appartient à une nouvelle sous-classe de facteurs trophiques homologues à la famille des thiorédoxines qui présente une extrémité C-terminale tronquée au sein du motif structural des thiorédoxines et n'a donc pas d'activité enzymatique. Cette protéine est codée par le gène nucleoredoxin-like 1 ( NXNL1 ), composé chez les mammifères d'un intron encadré par deux exons codants. L'épissage de l'unique intron de NXNL1 conservé détermine la production de la thiorédoxine RdCVFL qui réduit les cystéines oxydées des protéines des photorécepteurs [331], dont la protéine TAU [332]. La dualité de fonction du gène NXNL1 repose sur la protection des cônes par le facteur RdCVF et la protection des photorécepteurs contre les dommages causés par le stress oxydatif par RdCVFL [333-334-335-336-337-338-339] (fig. 45-10
Fig. 45-10Schéma du gène NXNL1 et des protéines RdCVFL et RdCVF (a), et modèle structural de RdCVF et RdCVFL (b). a. Les rectangles bleus représentent l'exon 1 et 2 de NXNL1. Le rectangle gris représente l'intron de NXNL1. La position du codon stop en phase dans l'intron est indiquée. En jaune sont représentées les deux isoformes short et long NXNL1 qui codent respectivement pour les protéines RdCVF et RdCVFL codées par NXNL1. b. La partie bleue représente la région homologue aux thiorédoxines; en jaune est représentée la région qui caractérise RdCVF dont son site d'interaction. Les cystéines du site catalytique CxxC sont indiquées en violet et la région spécifique de RdCVFL est représentée en rose.
Source : dessin de Cyrille Martinet.
).
Mise en évidence du récepteur et de la signalisation du facteur RdCVF
RdCVF interagit avec son récepteur basigin-1 (BSG1). Ce complexe va par la suite interagir avec GLUT1. Le complexe formé par RdCVF, BSG1 et GLUT1 accélère l'entrée du glucose dans les cônes, ce qui participe à leur survie. Tout comme les cellules cancéreuses, les cônes, qui sont des neurones, ne se divisent pas [340]; cependant, l'oxydation continuelle des lipides de leur segment externe qui porte la molécule d'opsine implique que 10 % de ce segment soit renouvelé quotidiennement après phagocytose par EPR. RdCVF stimule donc la glycolyse aérobie pour produire ces intermédiaires glucidiques nécessaires au renouvellement du segment externe des cônes [ 341] (fig. 45-11
Fig. 45-11Le mode d'action et la signalisation de RdCVF.RdCVF interagit spécifiquement avec BSG1 à la surface des cônes via son unique domaine transmembranaire. Cette interaction va induire le complexe RdCVF-BSG1-GLUT1 et accélérer l'entrée du glucose dans les cônes. La fonction des cônes est alors maintenue et, par extension, leur survie. Les cônes métabolisent le glucose par la glycolyse aérobie et induisent ainsi le renouvellement de leur segment externe quotidien après phagocytose par l'EPR [332–334].
Source : dessin de Cyrille Martinet.
).
Punzo et al. ont suggéré que la stimulation de mTOR pourrait prolonger la survie des cônes [344]. Plus récemment, il a été découvert que l'activation de la voie mTOR1 spécifiquement dans les cônes pouvait améliorer la survie des cônes dans des modèles RP [ 345]. Le rôle de la voie glycolytique dans le maintien du segment externe des photorécepteurs avait également été suggéré [ 346]. Xue et al. ont trouvé que la thioredoxine-interacting protein (Txnip) prolonge la survie des cônes [ 347], améliorant aussi la structure et la fonction mitochondriales de ces cellules dans les modèles souris de la RP. Les auteurs ont suggéré que cet effet pourrait être associé à un changement du choix du « carburant» des cônes, du glucose au lactose, qui pourrait être plus disponible pour les cônes dans la RP. Dans les modèles animaux de RP, les thérapies indépendantes des gènes ciblant les aspects métaboliques des cônes dégénérant se sont révélées prometteuses [ 348]. RdCVF et RdCVFL sont aujourd'hui un traitement de la RP en cours de développement et suscitent beaucoup d'espoir pour les patients atteints par cette maladie.
Développement d'une recherche translationnelle
L'ensemble de nos travaux indiquent que RdCVF est un facteur trophique issu des bâtonnets qui maintient les cônes en vie. Indépendamment des anomalies génétiques induisant la RP, le mécanisme protecteur de RdCVF, tout à fait original, repose sur le maintien de la fonction visuelle des cônes en agissant sur leurs segments externes où se concentrent les molécules photosensibles, les opsines. C'est un aspect important car, indépendamment des variants génétiques de 70 gènes distincts responsables de cette maladie rare, l'administration de RdCVF pourrait permettre de traiter à l'avenir les 4 millions de patients dans le monde qui souffrent de cette maladie incurable [ 342 , 343 , 349 , 350]. Sachant qu'il suffit de 50 % de cônes fonctionnels pour maintenir l'acuité visuelle et que 5 % de cônes suffisent pour maintenir une vision ambulatoire, l'administration de RdCVF et de RdCVFL serait également envisageable et bénéfique au stade avancé de la maladie. Ces travaux ont conduit au développement d'une étude pilote parallèle à celles des thérapies géniques qui existaient déjà, ou de greffe de rétine, pour maintenir la vision chez les patients atteints de RP. Cette étude préclinique consiste à injecter des virus adéno-associés qui codent pour RdCVF et RdCVFL en sous-rétinien à des souris rd10 , un autre modèle de RP (fig. 45-12
Fig. 45-12Traitement métabolique et redox de la rétinopathie pigmentaire. Injection sous-rétinienne de vecteur AAV (adeno-associated virus) recombinant codant pour les deux produits du gène NXNL1, le facteur trophique RdCVF et la thiorédoxine RdCVFL respectivement dans l'épithélium pigmentaire rétinien et dans les cônes.
Source : dessin de Cyrille Martinet.
).
La transfection de l'EPR visé remplacera la production de RdCVF par les bâtonnets pour protéger les cônes et, en même temps, les cônes transfectés (dans lesquels l'expression de RdCVFL sera rétablie) se protégeront de manière autocrine contre le stress oxydatif. À l'aide de tests fonctionnels et comportementaux, il a été démontré que l'acuité visuelle des animaux traités est maintenue pour une période prolongée [ 351]. Dans le but d'accélérer le développement de ce traitement de la RP, un environnement industriel a été fourni par le centre d'investigation clinique de l'hôpital des Quinze-Vingts, et la société de biotechnologie SparingVision a été créée en 2016 par T. Léveillard et J.-A. Sahel. Le transfert de cette approche de neuroprotection par thérapie génique a permis le démarrage d'un essai clinique.
Premier essai clinique de la thérapie génique SPVN06
La thérapie génique SPVN06 est indépendante du variant génétique causant la maladie dégénérative de la rétine. Elle comprend deux gènes humains codant pour RdCVF (action trophique) et RdCVFL (action antioxydante) empaquetés dans une enveloppe virale non pathogène. Le premier essai clinique chez l'homme, PRODYGY (NCT05748873) a été lancé en 2023, concomitamment dans deux établissements, l'un aux États-Unis et l'autre à Paris. Il a pour but d'évaluer la sécurité et la tolérance de SPVN06, avec une seule injection sous-rétinienne dans l'œil le plus affecté de 33 patients à un stade avancé de la maladie due à des variants génétiques dans les gènes RHO , PDE6A ou PDE6B . La première partie de cet essai clinique est consacrée à l'évaluation de trois doses croissantes de SPVN06 chez des patients avec une dystrophie rétinienne sévère. Les patients au stade « intermédiaire» de la maladie seront inclus dans une deuxième partie de l'essai clinique PRODYGY.
L'objectif de la thérapie SPVN06 est de ralentir ou de stopper la perte de vision des patients atteints de RP. Le critère d'évaluation principal de l'essai est la sécurité et la tolérance du SPVN06 12 mois après l'administration de l'injection de la thérapie génique. Les objectifs secondaires incluent l'identification des signes préliminaires d'efficacité à travers plusieurs critères structurels, fonctionnels et de qualité de vie. Le suivi à long terme de l'étude se concentrera sur la sécurité et la tolérance pendant un total de 5 ans après l'administration du traitement.
Conclusion et perspectives
Depuis l'autorisation de la mise sur le marché du Luxturna®, première thérapie génique approuvée pour une forme rare de rétinopathie pigmentaire, une large gamme d'approches thérapeutiques innovantes est entrée en essais cliniques : l'optogénétique, les oligonucléotides antisens, l'édition génomique ou la neuroprotection. Il est désormais admis qu'une approche thérapeutique indépendante du variant génétique causant la maladie pourrait s'adresser à une population de patients beaucoup plus importante que la thérapie génique « classique» [348].
D'autres approches indépendantes du gène causal sont en développement préclinique ciblant les phénomènes immunitaires [352], le métabolisme du glucose [353], la différenciation cellulaire [354], ou le stress oxydant [355].
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Ce texte est la traduction de Bennet J, Maguire AM. Lessons learned from the development of the first FDA-approved gene therapy drug, voretigene neparvovec-rzyl. Cold Spring Harb Perspect Med 2023; 13 : a04130. Reproduction autorisée.